СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОБЩЕЙ КОАГУЛЯЦИОННОЙ АКТИВНОСТИ ТРОМБОЦИТОВ Российский патент 1996 года по МПК G01N33/48 G01N33/86 

Изобретение относятся к биохимии и медицине, точнее: к способам контроля за состоянием тромбоцитарного звена гемостаза.

Известны способы оценки функциональной активности тромбоцитов, характеризующиеся тем, что для их осуществления используются достаточно сложные устройства, либо тем, что полученные с их помощью результаты отражают одно из свойств тромбоцитов и не дают информации об их общей гемокоагуляционной активности.

Так, известен способ измерения силы ретракции фибринового сгустка, характеризующей активность в них ретрактозима (А.С. Шитикова и соавт. Лабор. дело, 1975, N 4, с. 201).

Сущность способа заключается в том, что с помощью механоэлектрического преобразователя (механотрона 6Мх1С) измеряют силу ретракция фибринового сгустка плазмы или крови. Штырь механотрона, жестко соединенный с якорем, погружаемый в исследуемую жидкость до ее свертывания (в кювете с гидрофобной внутренней поверхностью) позволяет записать механическое сопротивление жидкости, нарастающее по мере наступления ретракции, следующей за свертыванием крови (плазмы), вызванным рекальцификацией или внесением тромбина.

Приведенный способ мы рассматриваем в качестве аналога заявляемого способа. Его недостатки использование комплекса аппаратуры (собственно механотрона, измерительной схемы, нестандартного термостатирующего устройства, кюветы с гидрофобными стенкам), а также то, что способ позволяет оценить лишь одно из свойств тромбоцитов, реализующееся на заключительном этапе свертывания способность вызывать ретракцию фибринового сгустка.

Существует способ определения ф. 4 тромбоцитов в плазме и реакцию высвобождения его в процессе агрегации (В.Г. Лычев. Лабор. дело, 1974, N 12, с. 730), выбранный нами в качестве прототипа по технической сущности.

Способ основан на учете свойства прогретой бедной тромбоцитами плазмы, являющейся источником ф. 4, влиять на тромбин-гепариновое время свертывания субстратной бедной тромбоцитами плазмы, являющейся источником фибриногена и плазменного кофактора гепарина (антитромбина Ш). Укорочение тромбин-гепаринового времени служит мерой активности ф. 4 тромбоцитов.

Для осуществления способа готовят рабочий раствор тромбина активностью 9-11 до 33-37 с, получают бедную тромбоцитами плазму (центрифугирование при 12 тыс. g, 20 мин), прогревают бедную тромбоцитами плазму 10 мин при 60^oС и удаляют осадок центрифугированием, надосадок используют для определения ф. 4.

Проводят определения в четырех следующих системах:
1. Смесь бедной тромбоцитами плазмы, физиологического раствора и тромбина;
2. Смесь нормальной бедной тромбоцитами плазмы, физиологического раствора, раствора гепарина и тромбина;
3. Смесь нормальной бедной тромбоцитами плазмы, и такой же, но прогретой исследуемой плазмы, растворов гепарина и тромбина;
4. Смесь нормальной и исследуемой бедной тромбоцитами плазм, гепарина и тромбина. Во всех системах устанавливают время свертывания. По разнице времени свертывания в системах 2 и 3 оценивают активность свободного ф. 4 плазмы, по разнице между системами 3 и 4 судят о доле ф. 4 в общей антигепариновой активности плазмы.

Аналогичное определение проводят в плазме, оставшейся после определения АДФ- и коллагензависимой агрегации тромбоцитов. Сопоставляя полученные здесь результаты с найденными в опытах 1-4, судят о "реакции высвобождения".

Этот способ мы рассматриваем как прототип заявляемого изобретения. К его недостаткам относятся необходимость в чрезвычайно тщательной подгонке активности гепарина и тромбина, отсутствие этих препаратов со стандартной удельной активностью, многочисленность процедур при осуществлении способа, оценка полученной информации как указание только на одно из свойств тромбоцитов, обеспечивающих их участие в свертывании крови, в то время как в действительности результат отражает общую коагуляционную активность тромбоцитов, так как в используемых системах проявляется эффект не только ф. 4, но и других гемокоагуляционных свойств тромбоцитов.

Задача изобретения разработка способа, позволяющего оценить общую гемокоагуляционную активность тромбоцитов плазмы без использования каких-либо нестандартизированных препаратов, с сокращенной продолжительностью анализа и с меньшими трудозатратами
Технический результат изобретения заключается в следующем.

Способ позволяет за короткий срок количественно (в процентах к норме) оценить общую коагуляционную активность тромбоцитов без применения нестандартных реагентов, без предварительного тестирования коммерческих препаратов, без предварительного прогревания плазмы.

Существенные признаки заявляемого изобретения заключаются в следующем:
1. Получают богатую тромбоцитами плазму центрифугированием пробы исследуемой цитратной крови с ускорением 3000 g, 10 мин;
2. Половину объема богатой тромбоцитами плазмы используют для получения бедной тромбоцитами плазмы, центрифугируя ее с ускорением 12000 g, 20 мин;
3. Определяют активированное время рекальцификации бедной тромбоцитами плазмы и смеси равных объемов бедной и богатой тромбоцитами плазмы, находят разницу между временем свертывания первой и второй проб, выражают ее в процентах к первой и находят значение общей коагуляционной активности тромбоцитов с помощью калибровочной кривой;
4. Калибровочную кривую строят, откладывая в полулогарифмической системе координат выраженное в процентах укорочение времени свертывания в присутствии разных разведений богатой тромбоцитами плазмы к времени свертывания бедной тромбоцитами плазмы.

Существенный отличительный признак способа:
Определяется степень сокращения активированного времени рекальцификации бедной тромбоцитами плазмы при добавлении к ней богатой тромбоцитами исследуемой плазмы.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения.

Для определения общей коагуляционной активности тромбоцитов предусмотрена такая последовательность операций:
1. 2 мл стабилизированной цитратом крови центрифугируют с ускорением 3000 g, 10 мин и переносят отделившуюся плазму в сухую пробирку получена богатая тромбоцитами плазма.

2. 0,5 мл богатой тромбоцитами плазмы центрифугируют с ускорением 12000 g, 15 мин, собирают надосадок получена бедная тромбоцитами плазма.

3. В пробирку, установленную на водяной бане при 37^oС вносят 0,2 мл бедной тромбоцитами плазмы и 0,1 мл взвеси каолина, после двухминутной инкубации добавляют 0,1 мл 0,277% раствора хлорида кальция и фиксируют время появления сгустка активированное время рекальцификации бедной тромбоцитами плазмы.

4. В пробирку, установленную на водяной бане при 37^oС, вносят 0,1 мл бедной и 0,1 мл богатой тромбоцитами плазмы, затем добавляют 0,1 мл 1% взвеси каолина и после двухминутной инкубации вносят 0,1 мл 0,277% раствора хлорида кальция, фиксируя момент появления сгустка активированное время рекальцификации смеси.

5. Рассчитывают степень укорочения активированного времени рекальцификации бедной тромбоцитами плазмы при добавлении к ней разного объема богатой тромбоцитами плазмы по формуле:
100 x (Тк -То) /Тк,
где Тк и То активированное время рекальцификации бедной тромбоцитами плазмы и той жe плазмы в присутствии богатой тромбоцитами плазмы. С помощью калибровочной кривой находят значение общей коагуляционной активности тромбоцитов.

Построение калибровочной кривой.

1. Смешивают равные объемы (по 0,5-1,0 мл) цитратной богатой тромбоцитами плазмы десяти здоровых доноров и половину смеси центрифугируют для получения бедной тромбоцитами плазмы, как указано в п. 2.

2. Из богатой тромбоцитами плазмы готовят разведения (разбавитель - бедная тромбоцитами плазма) таким образом, чтобы количество тромбоцитов, принимаемое в богатой плазме за 100% составляло 20 и 50%
3. Определяют активированное время рекальцификации смесей, содержащих равные объемы бедной тромбоцитами плазмы и плазмы, содержащей 100, 50 и 20% тромбоцитов, одновременно определяют активированное время рекальцификации 0,2 мл бедной тромбоцитами плазмы, не добавляя к ней богатой тромбоцитами плазмы. Рассчитывают по приведенной выше формуле (п. 5) степень укорочения активированного времени рекальцификации для каждой из трех смесей по сравнению с временем свертывания бедной тромбоцитами плазмы.

Результаты наносят на ординату (линейный масштаб) против соответствующих значений концентрации тромбоцитов, представленных на абсциссе в виде десятичных логарифмов (рисунок).

Пример определения:
1. Исследуемую плазму разделили на 2 порции, одну из них подвергли центрифугированию для осаждения тромбоцитов, получив богатую и бедную тромбоцитами плазму.

2. Определили активированное время рекальцификации бедной тромбоцитами плазмы 166 с, а также смеси бедная + богатая тромбоцитами плазма 103 с.

3. Рассчитали в процентах укорочение активированного времени рекальцификации при добавлении богатой тромбоцитами плазмы:
100 (166 103) /166 37,9
4. Нашли на калибровочном графике значение общей коагуляционной активности тромбоцитов, соответствующее величине 37,9 86%
Средняя ошибка средней (100 х 6/М) при определениях в одном образце плазмы 4,5% при n 5 или 2,7% при n 10.

Средняя ошибка средней при определении в группе из 5 лиц 9,8%
Приведенная ниже таблица характеризует заявляемый способ в сопоставлении со способом-прототипом.

Таким образом, заявляемый способ отличается отказом от использования нестандартизированных реагентов, меньшей трудоемкостью и сокращением в 4 раза времени для выполнения анализа, возможностью одновременного (параллельного) выполнения большего числа анализов.

Способ предназначен для научно-исследовательских лабораторий гемокоагулологического профиля и для клинико-диагностических лабораторий лечебных учреждений. Для его выполнения требуется минимальный набор лабораторного оборудования: водяной термостат, лабораторная центрифуга, секундомер и пробирки с диаметром от 4 до 100 мм. ТТТ1 ТТТ2

Использование: биохимия, медицина для количественного определения общей коагуляционной активности тромбоцитов. Сущность изобретения: получают бедную и богатую тромбоцитами плазму исследуемой крови, в качестве субстрата для определения активности тромбоцитов используют бедную тромбоцитами плазму, а в качестве исследуемого материала - богатую тромбоцитами плазму. Определяют активированное время рекальцификации бедной тромбоцитами плазмы без каких-либо добавок, а затем активированное время рекальцификации той же плазмы, предварительно добавляя к ней равный объем богатой тромбоцитами плазмы. По разнице между результатами первого и второго определения с помощью калибровочного графика находят значение коагуляционной активности тромбоцитов.

Способ количественного определения общей коагуляционной активности тромбоцитов, включающий получение богатой и бедной тромбоцитами плазмы, отличающийся тем, что устанавливают активированное время рекальцификации бедной тромбоцитами исследуемой плазмы и ее смеси с равным объемом богатой тромбоцитами плазмы из того же образца крови, по степени сокращения времени, выраженной в процентах, количественно оценивают суммарную гемокоагуляционную активность тромбоцитов, используя калибровочную кривую, построенную по данным определения суммарной коагуляционной активности тромбоцитов в пулированной донорской плазме различных разведений.