Стабилизированная урокиназа,обладающая тромболитической активностью,и способ ее получения Советский патент 1983 года по МПК A61K38/49 C12N9/72 C12N11/10 

to

IVD

СО

сх оо

Изобретение относится к химикофармацевтической промышленности, а именно к синтезу биологически активных химических соединений, проявляющих тромболитическую активность, в частности стабилизированной урокиназе .и способу ее получения. Описываемое соединение представляет собой продукт связывания урокиназы с синтетическим сополийером акриламида и акриловой кислоты .

Урокиназу используют в медицине как активатор плазминогена, поскольку она обладает хорошо выраженными тромболитическими свойствами. Урокиназу применяют при лечении таких заболеваний как легочная тромбоэмболия, тромбозы глубоких вен, заболевания сосудов головного мозга, инфаркт миокарда. .;сццнако терапия нативной урокиназой осложняется в связи с ее инактивацией под действием ингибиторов кровки и эндогенных протеаз, а также из-за невозможности создания высокого локального содержания препарата в пораженном органе. При лечении урокиназой необходимо неоднократно вводить высокие дозы препарата. Преодолеть указанные выше трудности позволяет связывание ферментов с высокомолекулярными носителями .

Известно производное урокиназн, которое получают следующим путем.; Урокиназу вшивают в полиакриламидный гель после обработки его (нитритом натрия в кислой среде. Диазотированный таким способом носитель взаимодействует азосочетаНием с ферментом.

При этом образуется водонерастворимое производное урокиназы, которое не может быть использовано в медицине tl3.

Известен способ получения ферментного препарата на основе пуллуланазы (КФ 3.2.1.40) путем ковалентного связывания фермента с био-гелем ICM-100 (сополимер акрилами да и акриловой кислоты) с помощью карбодиимида. Для получения иммобилизованного ферментного препарата частицы носителя (размер 100200 меш) обрабатывают 30 мин Е кислой среде ( 4) раствором фермента для.протекания адсорбции фермента на носитель, после чего в реакционную смесь добавляется карбодиимид. Полученный продукт фильтруют и промывают дистиллированной водой и буферными растворами 2.

Одйако данный способ не дает возможности получить стабилизированную Урокиназу, которую можно было бы использовать для медицинских целей, поскольку для лечебных ферментных

препаратов наиболее благоприятной формой практического использования является растворимая.Таким образом; использование в качестве носителя водорастворимого сополимера акриламида и акриловой кислоты (мол.вес. 10-200 тыс. ед.) с содержанием последней 1-20%, а также Изменение условий процесса -приводят к получению нового соединения, обладаю.пего ценными свойствами.

Цель изобретения - получение нового препарата - стабилизированной урокиназы, обладаквдей пролонгированной тромболитической активностью,

повьаиенной термостабильностью, т.е. расширение ассортимента и№лобилизованных и стабилизированных ферментов медицинского назначения.

Поставленная .цель достигается

свойствами стабилизированной урокимазы обшей формулы

б

т-с- тда-тр

где Т - остаток сополимера акриламида и акриловой кислоты с молекулярным весом 10200 тыс. ед. и содержан1|ем акриловой кислоты 1-20%; урокиназа, обладающая тром болитической активностью. Способ получения стабилизированной урокиназы за-ключается в том, что Урокиназу при температуре и рН 8,0-8,3 подвергают взаимодействию с сополимером акрилалвида и акриловой кислоты с молекулярным ве- ; сом 10-200 тыс.ед. и содержанием акриловой кислоты 1-20%, предварительно обработанным карбодиимидом.

Присоединение урокиназы к синтетическому высокомолекулярному носителю проходит через стадию активации карбоксильных групп сополимера карбодиилдадом О

0« ,HHRi

-Ct t R.U«C«im,- T-C-0-Cl. . .

гдеT - указанный вьвие сополимер, a затем активированные карбоксильные группы носителя реагируют с аминогруппами урокиназы

«

Т-С-О-С: -Ь H -N-Yp-

,

о

fl н н

- T-C-14H-Yp-f к-C-V

RI и R, 1 О

Способ осуществляется следующим 6«; образом. Высокомолекулярный носитель - с полимер акриламида и акриловой кис лоты при слабощелочных значениях рН растворяют в растворе фосфатного буфера, затем на холоду - 5-10 вносят в раствор определенное количество карбодиимида и через 20 м добавляют раствор урокиназы. Реакц связывания ведут 16 ч, после чего полученное производное урокиназы отделяют от других веществ с .помонг гель-хроматографического метода. Полученный продукт представляет собой урокиназу, хнг-ячески связанн с синтетическим полимерным носителем. Продукт полностью сохраняет биологическую активность по высоко молекулярным субстрата1М (например, плазминоген), не теряет каталитической активности при хранении в холодильнике () в растворимом виде в течение трех месяцев (в отличие от растворов кативного фермента) , обладает повышенной терио стабильностью и пролонгированной тромболитической активностью. Синтез водорастворимого полимер ного носителя осуществляют известным способом - радикальной сополимеризапией мономеров в присутствии персульфата аммония в водном растворе з). Сополимериэацию ведут при 4 ч,,Общая концентрацияIмономеров в реакционной смеси составляет 5 вес. %. Сополимер осг1ждают метанолом и .высушивают ацетоном Содержание акриловой кислоты в сополимере составляет 3 вес.%, что является оптимальным для процесса получения фepмeнтвыk производных. Следует отметить, что увеличение содержания акриловой кислоты в сополи юре выше 20% не ведет к увеличению количества связанного белка, а низкое содержание акриловой кислоты в сополимере делает его био инертным. Пример 1. В4 мг 0,001 М фосфатного буфера (рН 8,3) растворяют 20 мг.сополимера акриламида и акриловой кислоты с молекулярным весом 100000 ед. и содержанием акриловйй кислоты ,3%. Затем на холоду (4С) вносят в этот раствор 2,5 мг Д-этют-З-СЗ-диметиламинопропил)-карбодиимида и через 20 мин после этого приливают 1 мг раствора нативнсхй урокиназы в дистиллированной воде (250000 МЕ/мл). Реакцию связывания ведут 16 ч, а затем отделяют полученный препарат урокиназы, связанной с высококюлекулярным носителем, с помсмсью гель-хроматографии на колонне с сефадексом G-150. По кинетическим параметрам гидролиза низко1 4олекулярных субстратов, по- термостабильности по лученный препарат не уступает натиБНому ферменту. С носителем связывается до 80% йсходно го количества урокиназы, сохраняемая эстеразная и амидоли ичёская активность 78-81%. Препарат не теряет, каталитической активности по высокомолекулярньв.1 субстратам (плаэминоген), в системе in vitro с той же скоростью лизирует модельный тромб, как и препарат нативной урокиназы. В физиологических условиях при 37 С производное урокиназы с сополимером практически не теряет своей каталитической активности 2 сут. Нативный фермент в этих условиях теряет более 50% своей каталитической активности . Пример 2. Процесс проводится аналогично примеру 1, за исключением того, что реакция сврзывания урокиназы с полимершгм носителем молекулярного .веса 10000 ед. и содержанием акриловой кислоты 1% осуществляется в 0,1 М растворе фосфатного буфера при 25 С. В этоМ случае количество связанного с носителем фермента составляет 53%, а сохранявшая препаратсж эстеразная и смидолитическая активность 50-51%. Пример 3. Процесс проводится аналогично примеру 1, за исклю чением того, что реакцию присоединения урокииазы-к сополимеру молекулярного веса 200000 ед. и содержанием акриловой кислоты 20% ведут в 1,0 М растворе фосфатного буфера при . С носителем связывается в этом случае 20% урокиназы от исходного общего количества фермента. Сохраняемая препаратом эстеразная и амидолитическая активность 17%. Таким образом, производные урокиназы, полученные в примерах 1-3,содержат различное количество фермента, связанного с носителем, что объясняется важной ролью величины ионной силы раствора, зависящей от концентрации фосфатного буфера, при. проведении реакции связывания. Все производные обладают тромболитичёской активностью, сравниваемой с таковой для нативной урокиназы. КроМе того, как видно из примера, 1, полученные соединенияобладают повышенной термостабильностью й-длительный срок сохраняк т свою каталитическую активность. Тромболитические свойства стабилизированной урокиназы оцениваются по скорости лизиса тромба в среде буфера рН 7,4 в присутствии человеческого плазминогена (1 мг/мл). npenapai нативной и связанной с сополимером урокиназы взяты для тромболизиса в соотношении, обеспечивающем их одинаковую эотеразную актив.ность по низкомолекулярному субстрату (метиловый эфир ацетилглициллизина) .

Результаты проведенных экспериментов представлены в таблице, где tgcLпредставляет-собой отношение прироста оптической плотности раствора (в результате деструкции при тромболиэисе нерастворимого фибринового.сгустка и переходе его фрагментов в раствор) к величине Промежутка времени, за который оно происходит и является параметром, характеризующим скорость тромболизиса.

15

20

100

0,49

о

25

125

0,61 110 0,54 104 0,51

30

Таким образом, из результатов , приведенных в таблице, видно, что препараты ypoкинaзыJ, связанной с сополимером, даже превосходят по эффективности тромболитического дай ствия нативный фермент. Повьхиенная термостабильность полученных производных урокиназы озволяет ферменту сохранять свою каталитическую активность более длительный период времени, чем нативному препарату, а это ведет, в свою очередь, к пролонгации тромболитического действия полученных производных урокиназы.

Синтез таких производных позволя ет получать, биологически активные препараты пролонгированного действия, пригодные для терапевтического использования. Варьирование количества фермента, связанного с носителем, в зависимости от значения величины Ионной силы раствора, в котором протекает реакция связывания, удобно для индивидуального дозирования препарата. Применение таких производных урокиназы в медицине открывает новые возможности для эффективной борьбы с тромбозами, ведет к снижению расхода дорогостоящего ферментного препарата, облегчает его применение.

1. Стабилизированная урокиназа. рбыей формулы тЛ-то1-То где Т - остаток сополимера акриламида и акриловой кислоты с молекулярным весом 10200 тыс. ед. и содержанием акриловой кислоты 1-20% NH-T урокиназа, обладающая тромболитйческой активностью. 2. Способ получения стабили.зи« рованной урокиназы по п. 1, о т л ич.аюцийся тем, что урокиназу при, температуре 0-25 С и рН В,0-8,3 подвергают взаимодействию с сополимером акриламида и акрило-вой кислой с молекулярным весом 10-200 тыс. ед. и содержанием акриловой кислоты 1-20%, предварите тьно обработанным карбодиимидом.