Урокиназа,иммобилизованная на гепарине Советский патент 1985 года по МПК A61K38/49 C12N9/72 C12N11/00 

Изобретение относится к биооргани ческой химии а именно к синтезу биологически активных химических соеди нений, обладающих тромболитической и анчНпсоагулирующей активностью, Предлагаемые соединения представляют собой продзпст связьшания урокин зы с гепарином. Урокиназа, являясь активатором плазминоген в организме применяется как тромболитический агент. Гепарин представляет собой антикоагулирующее средство. Обычно вся тромболитическая терапия ведется гепаринизации. Известны производные урокиназы, представляющие собой комплекс урокиназы с гепарином, основанные на их электростатическом взаимодействии, которые получают инкубацией фермента с гепарином 1. В смесях гепарина и урокиназы образуются наибольшие количества производных, представляющих собой урокиназу, электростатически связанную с гепарином. Получаемые таким способом производные представляют собой урокиназу, электрически связанную с гепарином. Однако стабильность этих производных оказьшается сильно зависимой от величии ионной силы и рН раствора, что является препятствием для их использования в терапии. Соотношение активностей компонентов такого комплекса составляет 30000-100000 IU урокиназы на 100 IU гепарина. Количество гепарина в комплексе (100 IU) недостаточно для проявления значимого эффекта антикоагулянта в организме. Увеличение дозы препарата гепарината урокиназы приводит к тому, что наряду с увеличением количества гепарина (и следовательно, антикоагулирующей активности) увеличивается и количество связанной с ним урокиназы. Избыток тромболитика вызывает подавление системы свертывания крови. Таким образом, данный комплекс урокиназы с гепарином не характеризуется сбалансированным соотношением его компонентов, пролонгированной и повышенной тромболитической активностью. Целью изобретения является получение нового препарата - иммобилизог ванной урокиназы, обладакщей тромболитической активностью и антикоагулирукяцим действием. Цель изобретения достигается за счет свойств иммобилизованной урокиназы общей формулы 0 C-KlH-Yp где NH-YP - урокиназа, п 27-46, характеризующейся следующими параметрами;Молекулярная масса 70000+9000 Содержание белка 20-30 мас.% Сохраняемая каталитическая актив70-90% (от ность исходной) Специфическая 150000-200000 активность IU урокиназы/ 100 IU гепарина (9,3-9,94) 25-29 с-1 7,3-8,5 рН-оптимум и получаемой Связьшанием урокиназы с гепарином в слабощелочной среде при температуре от О до 25°С в течение 2-20 ч. Значения п, как и в молекуле гепарина, составляет 27-46. Способ осуществляют следующим образом. В 0,01-0,1 М фосфатном буфере рН ,5 растворяют гепарин, к которому затем осторожно добавляют избыток карбодиимида. Смесь инкубируют в течение получаса на холоду, а затем к ней добавляют раствор урокиназы и проводят инкубацию еще в течение 2-20 ч при температуре от 4 до 25°С. После этого полученное производное подвергают очистке диализом в течение 6 ч против дистиллированной во- ды и лиофидизируют. Связьшание урокиназы с гепарином происходит через стадию карбодиимидной активации карбоксильных групп гепарина с последующим взаимодействием с аминогруппами фермента (схема 1).

0 C-0-C-MHRi

УРОКИНАЗА,ИШОВИПИЗОВАННАЯ НА ГЕПАРИНЕ, общей формулы ОС-Ш-Ур -, -о он HOgS-O Ш-50зН п где NH - YP - урокиназа, п 27-46, обладакнцая пролонгированной тромболитической активностью и антикоагулирующим действием и характеризующаяся следующими параметрами: Молекулярная масса 70000+9000 Содержание белка 20-30 масД Сохраняемая каталитическая актив70-90% ность . (от исходной) Специфическая I 150000-200000 активность Ш урокиназы (Л lOOOiU гепарина,

0мн

1I

НОзЗ ЗОзН

Полученный продукт представляет собой урокиназу, ковалентно связанную с гепарином. Синтезированные производные водорастворимы, что весьма удобно ,для их повседневного клинического использования. На фоне гепарина заметно эффективнее действует фермент-тромболитик. Модификция урокиназы существенно не меняет ее кинетических свойств, не изменяется и термостабнльность, зато тромболитическоё действие приобретает пролонгированный характер. Остаточная каталитическая активность производного урокиназы в физиологических условиях составляет 70-90% от первоначальной активности нативного фермента

Таким образом, преимуществами описываемого препарата следует считать: возрастание тромбойитической активности предлагаемых соединений (в 1,5 раза), придание ей пролонгированного характера, а также появл

ление у них новых свойств - привитой антикоагулирующей активности. В результате для медицинской практики предлагается новое вещество препарат комплесного пролонгированного действия на ферментной основе. I

Увеличение молекулярной массы

синтезированного препарата способствует увеличению срока его действия в кровотоке.

Пример 1.В4мл 0,05 М фосфатного буфера рН 8,3 растворяют 8 мг гепарина, к которому осторожно добавляют на холоду (А°С) 5 мг 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида и смесь инкубируют при перемешивании в течение 30 мин. Затем к инкубационной смеси добавляют 1 МП раствора урокиназы 50.000 IU/мл инкубацию продолжают при 4°С в тёейие 16 ч. После этого раствор диализуют против дистиллированной воды течение 6. ч и лиофилизируют. В результате осуществления реакции связы вания с гепарином взаимодействует 90% белка от его исходного количества (п данным гельфильтрации на сефадексе Г-100), при этом фермент сохраняет 90% эстеразной активности от первоначальной. По термостабнльности полученное производное весьма близко к нативному ферменту, известному своей термостойкостью. Специфическая активность полученного производ ного 45000 IU/мл, содержание белка 30 мас.%. Пример 2. Процесс осуществляют также, как и в примере 1, за исключением того, что реакцию связывания урокиназы с гепарином проводят в 0,1 М фосфатном буфере рН 8,0. С гепарином связьтается 80% исход ного белка, при этом фермент сохраняет 78% эстефазной активности, и по термостабильности не уступает нативной урокиназе. Специфическая активность полученного производного 39000 IU/мл, содержание белка по весу 26%. Пример 3. Процесс осуществляют так же, как в примере 1, за исключением того, что реакцию связывания урокиназы с гепарином проводят в 0,01 М фосфатном буфере рН 8,5. С носителем связывается 85% исход ного белка при сохранении 75% исходной эстеразной активности. Специфическая активность 37000 IU/мл,.содер жание белка по весу 24%. Пример 4. Процесс проводят так же, как и в примере 1, за искхпочением того, что реакцию связьтания урокиназы с гепарином осуществляют в 0,01 М фосфатном буфере рН 8,3 при 25°С в течение 2 ч. В реакцию связывания вступает 85% белка от исходного, сохраняемая каталитическая эстеразная активность ферментного производного 75%. Кинетические свойства препарата, его термостабильност близки тем, что и в примере 1. Специ фическая активность 38000 IU/мл, содержание белка по весу 25%. Таким образом, из приведенных при меров следует, что количество связан ного с гепарином фермента меняется в зависимости от рН инкубации. Диапа зон рН 8,0-8,5 является оптимальным для протекания двух реакций: активации карбоксильных групп гепарина карбодиимидом и взаимодействия их с аминогруппами урокиназы. Именно полученные при таких значениях рН | ферментные производные (примеры 1-4) обладают наилучшими свойствами. Так, реакция каталитического гидролиза нативной урокиназой метилового эфира ацетилглициллизина осуществляется по схеме активации хода реакции ее субстратом (схема 2). Ч ES - Е + Р , к; 4 i-A SE + Р Продукты примеров 1-4 осуществляют катализ этой реакции по той же схеме. При этом модификация урокиназы гепарином существенно не меняет кинетические свойства урокиназы.. В табл. 1 приведены кинетические параметры реакции гидролиза метилового эфира ацетилглициллизина нативной и модифицированной урокиназой при 25°С 0,1 М КС и рН 7,8 (оптимум эстеразной активности). Таким образом, каталитические свойства модифицированной урокиназы, изученные на реакции гидролиза метилового эфира ацетилглициллизина, вполне сравнимы с каталитическими свойствами нативной урокиназы. Тромболитическую активность нативной и модифицированной урокиназы определяли по известной методикеC2j. с добавлением в раствор буфера 0,33 мг/мл плаэминогена человека. Препараты нативной и модифицированной урокиназы используют в соотношении, обеспечивающем .одинаковую оптическуй плотность при 280 нм. Результаты экспериментов приведены в табл. 2 (рН 7,4, комн.температура). tg d представляет собой отношение прироста оптической плотности раствора (в результате деструкции при тромболизисе нерастворимого фибринового сгустка и перехода его фрагментов в раствор) к величине промежутка времени, за который оно произошло, и характеризует скорость процесса тромболизиса. Представленные в табл. 2 данные показьшают, что в результате модификации урокиназы гепарином тромболитическая активность полученного фер