Способ получения модифицированной урокиназы Советский патент 1985 года по МПК A61K38/49 C12N9/72 C12N9/96 

00

У 00

со Изобретение относится к химикофармацевтической промьппленности, а именно к синтезу биологически активных химических соединений, обладающих сосудорасширяющей и тромбо литическай активностью. Известен способ получения модифицированной урокинаэы, связанной с высокомолекулярными носителями, обладающей тромболитической активностью Р Способ заключается в том, что урокиназу связывают с помощью бифункциояального реагента 4,4 -дииз тиоциано-2,2-стильбен дисульфоната с эритроцитарной массой человек Такой способ получения производных белка довольно трудоемок, а образующийся продукт не растворим в во де, что затрудняет его медицинское использование. Более близким по достигаемому результату является способ получения модифицированной урокиназы, ко торый заключается в том, что уроки назу подвергают взаимодействию с сополимером акриламида и акриловой кислоты с молекулярным весом 10200 тыс. ед. и содержанием акриловой кислоты 1-20%, предварительно обработанным карбодиимидом, причем щ5оцесс ведут при рН 8,0-8.3 2J , Получаемое производное обладает пролонгированной тромболитической активностью, растворимо в воде, является биосовместимым с живым организмом. Таким образом, известный способ обеспечивает получение биологически активного вещества, обладающего лишь одним видом специфического действия на живой организм, что ог раничивает сферу его возможного использования, В связи с этим создание препаратов , обладающих одновременно несколькими видами биологической активности, весьма перспективно, поскольку за счет многосторонности действия препарата снижается количество назначаемых больному лекарственных средств, из-за пролонгации действия компонентов препарата повьшается эффективность терапии заболевания уменьшается риск лекарственной болезни. . Целью изобретения является обес печение комплексной биологической активности модифицированной урокиназы, а именно - комплексной пролонгированной тромболитической и сосудорасширяющей активности целевого продукта. Указанная цель достигается описываемым способом получения модифицированной урокиназы, который заключается в том, что урокинаэу подвергают взаимодействию с нитропруссидом натрия при рН 8,3-9,0. Соединения, получаемые описываемым способом, представляют собой продукт связывания урокиназы с нитропруссидом натрия. Нитропруссид натрия обладает гипотензивным действием за счет дилятирующего воздействия на гладкую мускулатуру периферических кровеносных сосудов и снижения общего периферического сопротивления. Гипотензивное действие нитропруссида натрия при его введении в организм проявляется быстро, однако и быстро заканчивается при прекращении введения препарата. Урокиназа, являясь активатором плазминогена в организме, обладает тромболитическими свойствами, в связи с чем ее применяют при лечении заболеваний, сопровождающихся повышением внутрисосудистой коагуляции . При тромбозах и особенно при эмболиях довольно часто наблюдаются сосудистые спазмы. Ликвидация таких нарушений, очевидно, будет более эффективной не только при использовании тромболнтических, но и сосудорасширяющих средств. Особенностью действия нитропруссида натрия является его способность влиять на тонус артериол и вен. Способ осуществляется следующим образом. К урокиназе в 0,001 - 0,3 М растворе фосфатного буфера добавляют Нитропруссид натрия, реакцию проводят при температуре от О до в слабощелочной среде в течение 0,1-5,0 ч. Затем полученное производное подвергают очистке диализом в течение 16 ч против дистиллированной воды. Взаимодействие урокиназы с нитропруссидом натрия происходит по схеме циангидринного синтеза, когда карбонильная компонента белка связыc :o+esN. вается с циановой компонентой нитропруссида натрия: CsNJ

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОДИФИЦИРОВАННОЙ УРОКИНАЗЫ, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью обеспечения комплексной пролонгированной тромболитической и сосудорасширяющей активности целевого продукта, урокиназу подвергают взаимодействию с нитропруссидом натрия при рН 8,3-9,0. . (Я

+ Н20.

NJ

Вместе с тем связывание нитропруссида с урокиназой проходит и через взаимодействие трехвалентного железа с сульфгчдрильньми группами белка: . . . .

E-SH+: Ге (CN)5 N0 г E-S-Fe ( + . + HCN :

IbieHHo таким способом происходит рйстворение нитропруссида натрия в крови и тканях, когда трехвалентное железо из молекулы нитропруссида натрия йззймодействует с сульфгидрильньвчги группами эритроцитов.

Полученный продукт представляет собой згрокина:зу, модифицированную нйтрогфуссидом натрия. При этом нитропруссид натрия оказывается переведенным в состояние, когда он постепенно сходит с белковой глобулы, проявляя свое пролонгированное гипотензивное действие. Фермент после модифик;ации сохраняет 85-90% исходной катгшитической активности (в качестве субртрата применяют метиловый эфир ацетилглицшшизйна) по термостабняьности весьма стоек и не ус1тгпает нативнрму белку, ингиЙ1руетсяппазмац«тратом заметно меньше, чем нативный препарат. Продукт сохрйкяёт свою П1 рлонгиррван«ую биологическую активность при хранении в холодильнике () s растворвннрм видб в течение месяца.

Ирин ер 1« В 4 мл Ojl м фосфатногобуфера рН 8,8 растворяют 250000 iU урокиназы ( мг сухого вещества, 10 М), затем вносят В раствор 50 мг нитропруссида натрия (210 М) и смесь инкубируют пзр в течение 3 ч. Шсле этого npeltiapaT подвергают очистке диализом в течение ночи против дистиллированной воды. КонЦентрадая свяон

.

+ ОН

15 эанного с ферментом нитропруссида

М. Фермент сохраняет 85%. I своей эстеразной активности (AGL Me), не уступает по термостабильности натинному белку, слабее чем он

0 ингибируется плазма цитратом. Содержание белка в препарате 6.5%. Щ)одукт представляет собой бурокоричневый порошок, легко растворимый в воде и спирте (до 40 мг/мл).

5 / П р и м е р 2. Процесс npQBOдят так же, как ив примере 1, за исключением того, что реакцию мо диФикации урокиназы нитропруссидом натрия осуществляют в .0,001 М фос- .

0 фатом буфера, ,0 при в течение 5. Остаточная каталитическая активность фермента 87%. При этом концентрация связанного с белком йитропруссида натрия 1-10 М.

. Свойства урокиназы близки тем, что приведены в примере 1. . Содержание белка в препарате

74%. ;; - . . - - .. - ;

при м ер 3. Процесс проводят также, как и в примере 1, за исключением того, что реакцию модификахщи урокиназы нитропруссидом натрия ведут в 0,3 М растворе фосфатного буфера рН 8,3 при 0°С в

течение 0,1 ч. Остаточная катали-тическая активность фермента 902. При этом с ферментом связывается М нитроируссида натрия, а свойства урокиназы близки тем, которые указаны & примере 1.

Содержание белка в препарате 80Z, При этом модификация урокиназы нитррпруссидок натрия не вызывает сильного изменения свойств феуаеп та. Так,реакция каталитического гидролиза урокиназой синтетического субстрата метилового эфира ацетилглищшлизина осуществляется по схеме активации хода реакции субстратом (схема i). Продукты примеров 1-3 также осуществляют эту реакцию по указанной схеме. Е бЙгЕб- Е Р- .V „ И:,5Е --Е+Р Кинетические параметры этой реакции для препаратов натнвной и мо дифицированной урокиназы приведены в табл. 1 (рН 8,3; 25°С; 0,1 М Производные урокиназы, полученные в примерах 1-3, содержат различ ное количество нитропруссида натрия, связанного с ферментом. Это объясняется важной ролью величины рП инкубационной смеси, когда реак ционноспособные группы, важные для реакции связывания, должны быть ио зованы, а при этом саМа реакция об ратима. Оптимальным значением явля ется рН 8,8. За счет связывания с глобулой белка выход в кровоток активной формы нитропруссида натри замедляется, в результате чего его сосудорасширяющее действие приобре тает фолонгированный характер. Для определения гипотензивного эффекта нитропруссида натрия, связанного с урокиназой. был проведен эксперимент на крысах линии Вистар. Наркоз осуществляли с помощь тиопё нтала натрия. Затем выделяли сонную артерию и яремную вену, в, которые вводили полиэтиленовые катетеры Непрерывно регистрировали артериальное давление до введения препарата,в момент и после введения. 1 этап одата заключался во внут ривенном введении нативного нитропруссида натрия в дозе 30 мкг/кг веса, животного. Препарат вводили б люсоМ. Следюга за максимальной величиной снижения среднего артериал ного давления и за временем его возвращения к исходным цифрам. На II этапе опыта вводили нитро пруссйд натрия, иммобилизованньй н урокйназе. Оценивали те же парамет ры. Получены следующие результаты: введение нативного препарата вызывало снижение среднего АД на 4050% по отношению к исходному. Максимум снижения наблюдался через 1124 с после введения болюса. Возвращение АЦ к ис:содному уровню происходило в среднем через 1 мин. Введение иммобилизованного препарата вызьгеало снижение среднего АД на 65-70% от исходного через 1521 с от начала введения. Вслед за этим наблюдалось постепенное повышение АД и через 3,5-7 мин оно воз- . вращалось к исходному уровню. Таким образом, нитропруссид натрия, связанный с урокиназой, в сопоставимой дозе при введении болюсом действует в 3,5-7 раз дольше (длительнее) , чем препарат нитропруссида натрия в свободном виде, о чем свидетельствуют приведенные в табл. 2 результаты. Эксперименты по лизису тромбов препаратами урокиназы, модифицированной нитропруссидом натрия, были проведены в соответствии с известной М1етодикой з с добавлением в раствор буфера человеческого плазмикоге-, на (0,4 мг/мл). Препараты нативной и модифицированной урокиназы были взяты для тромбопизиса в соотношении, обеспечивающем их одинаковую экстреразную активность по низкомолекулярному субстрату метиловому эфиру ацетилглицнллизина. Результаты экспериментов приведены в табл. 3, где tg (К. представляет собой отношение прироста оптической плотности раствора (в результате деструкции при тромболизисе нерастворимого фибринового сгустка и перехода его фрагментов в раствор) к величине промежутка времени, за который оно произошло и является параметром, характеризующим скорость тромболизиса. I Представленные в таблице результаты наглядно показывают, что по эффективности тромболизиса препараты модифицированной нитропруссидом натрия урокиназы не уступают препаратам нативного фермента, являющегося высокоактивным тромбоЛитиком. Пониженная ингибируемость (приблизительно в 3-5 раз) плазмацитратом препаратов модифицированной урокиназы по срапнению с наТивным белком обеспечивает более длительный период тромбояитического действия этого препарата в организме.

Таким образом, ковалентное присоединение нитропруссида натрия к урокиназе позволяет получить новый препарат, обладающий сосудорасширяющим и тромболитическим дейс.вием. При этом замедление перехода фрагментов молекул нитропруссида натрия с глобулы урокиназы в раствор обуславливает пролонгированный характер действия этого вазодиллятатора, а модификация урокиназы таКИМ низкомолекулярным лигандом как нитропрусеид натрия не меняет существенно кинетические свойства фермента, пошгаает его ингибируемость компонентами крови, за счет чего возрастает время активного функционирования тромболитика в организме. Таким образом, полученный препарат представляет собой новое средство комбинированного воздействия на заболевание, причем сосудорасширяющие и тромболитические свойства

5,5 X 10- 2,14 X 10

урокиназа

9,1 X 10 5,7 X 10 примера 1

7jO X 10 примера 2

6,7 X 10 3,2 X 10 примера 3

его компонентов оказываются у него не аддитивными частями, а усиливают друг друга, придавая характер пролонгированного действия получаемому производному.

Получение терапевтических средств расширенного спектра действия несомненно весьма актуально, поскольку ведет не только к развитию новых методов терапии, вооружает врачей высокоэффективными лекарственными средствами, но и облегчает сам курс лечения, является весьма удобным и для медицинской практики, сокращая число инъекций больному. Простота и легкость синтеза модифицированной нитропруссидом натрия урокиназы позволяет надеяться на возможность быстрого получения этого препарата комбинированного действия. Появление такого лекарственного средства в арсенале врача расширит возможности борьбы с заболеванием и позволит перейти от струйных методов введения препарата к ин7.екционным.

Таблица 1

,-9

4,3 X 10 Гипотензивный эффект урокиназы, Величина снижения артериально ГТрепарат го давления, % от исходного Свободный нитропруссид натрия47 Продукт примера 170 Продукт примера 267 Продукт примера 365 Тромболитическое действие урокиназы, мо Вид препарата Нативная урокиназа Продукт примера 1 Продукт примера 2 Продукт примера 3

Таблица 2 натрия Скоро модифицированной нитропруссидом натрия Время махсималь- Время, за ко- кого снижения ар- торое артеритериального дав- альное давлеления, с ние поднимается до первоначальногоуровня, с 1860 21420 .18300 15210 Таблица 3 дифицированной нитропруссидом сть лизиса тромба 0,16100 0,18. 113 0,17106 О,15