СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦИИ L-ФЕНИЛАЛАНИН-АММОНИЙ-ЛИАЗЫ НА МАГНИТНЫХ НАНОЧАСТИЦАХ Российский патент 2012 года по МПК C12N11/14 C12N9/88 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу иммобилизации на поверхностно-модифицированных магнитных наночастицах фермента L-фенилаланин-аммоний-лиазы, осуществляющего биотрансформацию L-фенилаланина до аммиака и транс-циннамовой кислоты. Изобретение может быть использовано в качестве терапевтических композиций, а также для создания специализированных продуктов питания для больных фенилкетонурией.

Иммобилизованные ферменты обладают рядом очевидных преимуществ перед нативными: легкость отделения гетерогенного биокатализатора от реакционной среды; непрерывность проведения ферментативного процесса с возможностью регулирования скорости катализируемой реакции и выхода продукта; направленное изменение свойств фермента (специфичность, зависимость каталитической активности от рН и других параметров среды, стабильность к денатурирующим воздействиям); возможность регулирования каталитической активности иммобилизованных ферментов путем изменения свойств носителя.

В данной области предложено множество технических решений, среди которых наибольшее распространение получили химические способы иммобилизации ферментных препаратов, суть которых заключается в ковалентном связывании биомолекул с инертным носителем, модифицированным реакционно-способными функциональными группами (амино-, азидо-, карбоксильные, гидроксильные и др.). Однако в большинстве своем эти способы иммобилизации имеют ряд недостатков, а именно использование дорогостоящих материалов и реактивов для иммобилизации, трудоемкость и многостадийность методик.

Известен способ иммобилизации (см. пат. US №WO 2009120916 (A1), МПК С08K 3/08, заявл. 28.03.2008, опубл. 10.01.2009) биообъектов на поликарбонатных нанокомпозитах, представляющих собой металлические наночастицы, покрытые слоем поликарбоната полимеризацией в реакционной смеси. В данном случае поликарбонатные нанокомпозиты получают из смеси дигидроксисоединений, активированного карбоната, металлического прекурсора и растворителя. Затем реакционная смесь подвергается полимеризации с образованием поликарбонатного нанокомпозита, представляющего собой поликарбонатную матрицу с распределенными частицами металла. В качестве прекурсоров при этом используют оксиды таких металлов, как золото, платина, палладий, кобальт, железо, никель, магний. Данный способ иммобилизации отличается такими недостатками, как использование дорогостоящих металлов и невысокая удельная активность полученных препаратов.

Также известно изобретение (см. пат. IT №WО 2009040843 (А2), МПК А61K 47/48, заявл. 04.08.2008, опубл. 02.04.2009), описывающее способ получения неорганических микро- и наночастиц оксидов металлов с регулируемой пористостью, используемых в качестве носителей для биомолекул. Данное техническое решение описывает неорганические мицеллярные композиты, функционализированные с использованием различных реагентов с помощью процесса графт-сополимеризации. Данное техническое решение имеет следующие недостатки: многостадийность процесса и невысокая стабильность препаратов.

Известен также способ полимеризационной иммобилизации биологических макромолекул (см. пат. РФ №RU 2216547 (С2), заявл. 16.10.2001, опубл. 20.11.2003), описывающий композит для присоединения олигонуклеотидов, белков и нуклеиновых кислот, структура которых включает активные функциональные группы: - амино, сульфгидрильные и т.д. В качестве мономеров в данном техническом решении используются такие соединения, как акриламид, метакриламид, 2-гидроксиэтилэтилметакрилат или производные акриловой, метакриловой, коричной, кретоновой и других ненасыщенных кислот. Недостатки данного изобретения следующие: использование токсических соединений и узкий диапазон оптимальных условий функционирования: рН и температура.

Наиболее близким к заявляемому изобретению - прототипом - является техническое решение (см. пат.US №ЕР 0230649 (А1), МПК C12N 11/10, заявл. 23.12.1986, опубл. 05.08.1987), заключающееся в иммобилизации L-фенилаланин-аммоний-лиазы путем добавления полиамина, хитозана и многофункциональных соединений, содержащих аминогруппы, таких как глутаровый альдегид. Примеры полиаминов, используемых в данном изобретении, включают полиэтилендиамин, полиэтиленимин, полидиэтилентриамин, политриэтилентетрамин, полипентаэтиленгексамин или полигексаметилендиамин. В данном случае глутаровый альдегид выполняет функцию конденсирующего агента, посредством которого происходит образование ковалентной связи между функциональными группами фермента и носителя.

Основными недостатками данного технического решения следует считать относительно низкую удельную активность иммобилизованного препарата и узкий диапазон условий функционирования.

Задачей технического решения является повышение удельной активности и стабильности иммобилизованного препарата L-фенилаланин-аммоний-лиазы за счет химического взаимодействия реакционно-способных функциональных групп молекулы фермента с поверхностью магнитных наночастиц, что открывает перспективы многократного использования биокатализатора в технологическом процессе и непрерывного проведения ферментативного процесса с возможностью регулирования скорости катализируемой реакции и выхода продукта. Данные характеристики иммобилизованных препаратов позволят снизить их себестоимость. Использование магнитных наночастиц в получении иммобилизованных ферментных препаратов является перспективным в связи с тем фактом, что они обладают развитой активной поверхностью и высокой сорбционной емкостью, а также способны приближаться к биообъекту и связываться с ним вследствие размеров, сопоставимых с размерами клеток, вирусов, белков, ДНК. Проведенный поиск показал, что в источниках информации отсутствуют технические решения, связанные со всей совокупностью отличительных признаков, изложенных в изобретении.

Технический результат достигается за счет использования в качестве носителя для иммобилизации магнитных наночастиц, представляющих собой оксиды металлов. Выбор в качестве наночастиц оксидов металлов обусловлен их широким распространением и невысокой стоимостью. Данная техническая задача реализуется за счет модификации поверхности магнитных наночастиц функциональными группами с последующим ковалентным присоединением фермента L-фенилаланин-аммоний-лиазы в присутствии конденсирующего агента 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида.

Способ получения поверхностно-модифицированных магнитных наночастиц для иммобилизации биологических веществ включает выполнение следующих операций. На первом этапе осуществляется получение магнитных наночастиц, содержащих на поверхности электрофильные сложноэфирные группы, путем взаимодействия полиметилметакрилата, соответствующего хлорида металла и диэтиленгликоля. Вторая стадия заключается в формировании на поверхности наночастиц слоя аминопропилтриэтоксисисилана за счет протекания реакции аминолиза электрофильных фрагментов носителя. Полученные наночастицы служат для последующей иммобилизации ферментов с использованием 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1

Готовят смесь полиметилметакрилата, хлорида железа (III) и диэтиленгликоля, нагревают при перемешивании до 220°С. Затем к смеси добавляют раствор гидроксида натрия в диэтиленгликоле. Через несколько минут образуются наночастицы Fе₃O₄ с поверхностными сложноэфирными группами, которые отделяют центрифугированием. Образующиеся магнитные наночастицы пригодны для иммобилизации биологических веществ посредством конденсирующего агента.

На второй стадии получения ферментного препарата на поверхности наночастиц Fе₃O₄ формируют слой аминопропилтриэтоксисилана за счет протекания реакции аминолиза электрофильных фрагментов носителя. Важно избегать присутствия воды в системе на этой стадии, поскольку ее наличие приводит к гидролизу аминопропилтриэтоксисилана и образованию олигомерных силанов. Поэтому в отдельной камере объемом 30 см³ наночастицы Fе₃O₄ (1,0 мг) покрывают газообразным 3-аминопропилтриэтоксисиланом (1 см³) при атмосферном давлении и температуре 70°С в течение 30 минут. После остывания образец обрабатывают этиловым спиртом три раза по 5 см³ и высушивают на воздухе. Далее наночастицы Fе₃O₄ (1,0 мг) обрабатывают 0,5%-ным раствором 3-аминопропилтриэтоксисилана (растворитель - смесь этанол: вода 1:1) в течение одного часа при температуре 50°С. На этом этапе происходит совместная поликонденсация силана с триалкоксисилановыми группами. По окончании процесса модификации наночастицы Fе₃O₄ несколько раз промывают растворителем вода - этиловый спирт (1:1) и готовят суспензию наночастиц Fе₃O₄ с концентрацией 5 мг/см³ в 0,1М фосфатном буфере (рН 7,8).

Далее 200 мкл полученной суспензии инкубируют с 200 мкл 100 мМ 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида в 0,1М фосфатном буфере в течение трех часов при непрерывном перемешивании при комнатной температуре. По окончании инкубации суспензию промывают три раза 0,025М фосфатным буфером и готовят суспензию в 500 мкл 0,1М фосфатного буфера. На следующей стадии смешивают 20 мкл L-фенилаланин-аммоний-лиазы с 500 мкл 0,1М фосфатного буфера и инкубируют полученный раствор с 500 мкл суспензии наночастиц Fе₃О₄ в 0,1М фосфатном буфере при температуре 30°С в течение двух часов. По окончании иммобилизации наночастицы Fе₃O₄ промывают 0,025М фосфатным буферным раствором до исчезновения активности в промывных водах. Полученный иммобилизованный препарат хранится в виде суспензии наночастиц с ковалентно связанным ферментом в 1000 мкл 0,1М фосфатного буфера. Физико-химические характеристики L-фенилаланин-аммоний-лиазы, иммобилизованной на наночастицах Fе₃O₄, представлены в табл.1. В качестве контроля в данном случае используют L-фенилаланин-аммоний-лиазу, иммобилизованную на немодифицированных наночастицах Fе₃O₄ адсорбционным способом.

В табл.2 представлены данные, полученные при исследовании стабильности иммобилизованной на наночастицах Fе₃O₄ L-фенилаланин-аммоний-лиазы, по сравнению с контролем при хранении. Из табл.2 следует, что иммобилизация L-фенилаланин-аммоний-лиазы на наночастицах Fе₃O₄ приводит к стабилизации фермента. Так, по истечении 30 суток хранения иммобилизованная на наночастицах Fе₃O₄ L-фенилаланин-аммоний-лиаза сохраняет 65,5% активности, в то время как в контрольном опыте сохраняется 32,9% активности.

Таблица 1 Физико-химические параметры иммобилизованной L-фенилаланин-аммоний-лиазы Способ иммобилизации Удельная активность фермента, ед./мг белка Удельная активность фермента, % от нативного Оптимум рН Температурный оптимум, °С Иммобилизация на модифицированных наночастицах Fе₃O₄ 0,53 60,9 7,5-9,0 30±3 Контрольный опыт 0,33 37,9 8,0-9,0 30±1

Таблица 2 Стабильность при хранении L-фенилаланин-аммоний-лиазы, иммобилизованной на наночастицах Fе₃О₄, по сравнению с контролем Продолжительность хранения, сутки Остаточная активность фермента, % L-фенилаланин-аммоний-лиаза, иммобилизованная на наночастицах Fе₃O₄ Контрольный опыт 5 98,0 91,5 10 95,6 85,0 15 82,4 69,8 20 77,6 57,0 25 72,0 40,5 30 65,5 32,9

Пример 2

Смесь полиметилметакрилата, хлорида никеля и диэтиленгликоля тщательно перемешивают и нагревают до 180°С. К реакционной смеси добавляют раствор гидроксида натрия в диэтиленгликоле. Образующиеся через несколько минут наночастицы NiO с поверхностными сложноэфирными группами отделяют центрифугированием. Следующей стадией получения ферментного препарата является формирование слоя аминопропилтриэтоксисилана за счет протекания реакции аминолиза электрофильных фрагментов носителя. Для этого в отдельной камере объемом 50 см³ наночастицы NiO (5,0 мг) покрывают газообразным 3-аминопропилтриэтоксисиланом (2 см³) при атмосферном давлении и температуре 80°С в течение 20 минут. После остывания образец обрабатывают этиловым спиртом три раза по 5 см³ и высушивают на воздухе. Далее наночастицы NiO (1,0 мг) обрабатывают 0,5%-ным раствором 3-аминопропилтриэтоксисилана (растворитель - смесь этанол: вода 1:1) в течение одного часа при температуре 70°С. На этом этапе происходит совместная поликонденсация силана с триалкоксисилановыми группами. По окончании процесса модификации наночастицы NiO несколько раз промывают растворителем вода - этиловый спирт (1:1) и готовят суспензию наночастиц NiO с концентрацией 5 мг/см³ в 0,1М фосфатном буфере (рН 7,8).

Последующая иммобилизация L-фенилаланин-аммоний-лиазы на наночастицы NiO посредством конденсирующего агента 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида осуществляется аналогично примеру 1. Физико-химические характеристики L-фенилаланин-аммоний-лиазы, иммобилизованной на наночастицах NiO, по сравнению с контролем представлены в табл.3.

В табл.4 представлены данные, полученные при исследовании стабильности иммобилизованной на наночастицах NiO L-фенилаланин-аммоний-лиазы, по сравнению с контролем при хранении. Результаты, представленные в табл.4, свидетельствуют о том, что иммобилизация L-фенилаланин-аммоний-лиазы на наночастицах NiO приводит к стабилизации фермента. Так, по истечении 30 суток хранения иммобилизованная на наночастицах NiO L-фенилаланин-аммоний-лиаза сохраняет 64,4% активности, в то время как в контрольном опыте сохраняется 32,9% активности.

Таблица 3 Физико-химические параметры иммобилизованной L-фенилаланин-аммоний-лиазы Способ иммобилизации Удельная активность фермента, ед./мг белка Удельная активность фермента, % от нативного Оптимум рН Температурный оптимум, °С Иммобилизация на модифицированных наночастицах NiO 0,65 74,7 7,3-9,2 30±4 Контрольный опыт 0,33 37,9 8,0-9,0 30±1

Таблица 4 Стабильность при хранении L-фенилаланин-аммоний-лиазы, иммобилизованной на наночастицах NiO, по сравнению с контролем Продолжительность хранения, сутки Остаточная активность фермента, % L-фенилаланин-аммоний-лиаза, иммобилизованная на наночастицах NiO Контрольный опыт 5 95,0 91,5 10 93,2 85,0 15 80,1 69,8 20 74,0 57,0 25 69,5 40,5 30 64,4 32,9

Пример 3

Для получения поверхностно-модифицированных наночастиц ТiO₂ готовят смесь хлорида титана (IV), полиметилметакрилата и диэтиленгликоля, после чего нагревают ее при перемешевании до 220°С. Затем к реакционной смеси добавляют гидроксид натрия в диэтиленгликоле. Через несколько минут образуются наночастицы ТiO₂, которые отделяют центрифугированием. Следующий этап - образование слоя аминопропилтриэтоксисилана за счет протекания реакции аминолиза электрофильных фрагментов носителя. Для этого в отдельной камере объемом 10 см³ наночастицы TiO₂ (1,0 мг) покрывают газообразным 3-аминопропилтриэтоксисиланом (1 см³) при атмосферном давлении и температуре 100°С в течение 60 минут. После остывания образец обрабатывают этиловым спиртом три раза по 5 см³ и высушивают на воздухе. Далее частицы ТiO₂ (1,0 мг) обрабатывают 0,5%-ным раствором 3-аминопропилтриэтоксисилана (растворитель - смесь этанол: вода 1:1) в течение двух часов при температуре 90°С. На этом этапе происходит совместная поликонденсация силана с триалкоксисилановыми группами. По окончании процесса модификации наночастицы ТiO₂ несколько раз промывают растворителем вода - этиловый спирт (1:1) и готовят суспензию наночастиц с концентрацией 5 мг/см³ в 0,1М фосфатном буфере (рН 7,8).

Иммобилизацию L-фенилаланин-аммоний-лиазы на наночастицы ТiO₂ посредством конденсирующего агента 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида осуществляют аналогично примеру 1. Физико-химические характеристики L-фенилаланин-аммоний-лиазы, иммобилизованной на наночастицах ТiO₂, по сравнению с контролем представлены в табл.5.

В табл.6 представлены данные, полученные при исследовании стабильности иммобилизованной на наночастицах TiO₂ L-фенилаланин-аммоний-лиазы, по сравнению с контролем при хранении. Результаты, представленные в табл.6, свидетельствуют о том, что иммобилизация L-фенилаланин-аммоний-лиазы на наночастицах ТiO₂ приводит к стабилизации фермента. Так, по истечении 30 суток хранения иммобилизованная на наночастицах ТiO₂ L-фенилаланин-аммоний-лиаза сохраняет 75,0% активности, в то время как в контрольном опыте сохраняется 32,9% активности.

Таблица 5 Физико-химические параметры иммобилизованной L-фенилаланин-аммоний-лиазы Способ иммобилизации Удельная активность фермента, ед./мг белка Удельная активность фермента, % от нативного Оптимум рН Температурный оптимум, °С Иммобилизация на модифицированных наночастицах ТiO₂ 0,71 81,6 7,4-9,1 30±4 Контрольный опыт 0,33 37,9 8,0-9,0 30±1

Таблица 6 Стабильность при хранении L-фенилаланин-аммоний-лиазы, иммобилизованной на наночастицах TiO₂, по сравнению с контролем Продолжительность хранения, сутки Остаточная активность, % L-фенилаланин-аммоний-лиаза, иммобилизованная на наночастицах ТiO₂ Контрольный опыт 5 98,7 91,5 10 97,2 85,0 15 90,3 69,8 20 85,4 57,0 25 81,5 40,5 30 75,0 32,9

Таким образом, иммобилизация L-фенилаланин-аммоний-лиазы на поверхностно-модифицированных наночастицах оксидов металлов открывает перспективу модуляции каталитических свойств фермента. Данное изобретение обладает рядом преимуществ перед прототипом:

- возможность использования в качестве инертного носителя магнитных наночастиц, имеющих ряд преимуществ перед макрообъектами;

- повышение удельной активности и стабильности иммобилизованных препаратов;

- оптимизация условий функционирования иммобилизованных препаратов;

- упрощение и удешевление технологии получения иммобилизованных препаратов.

Стабилизирующее действие наночастиц оксидов металлов на L-фенилаланин-аммоний-лиазу, очевидно, обусловлено конформационными изменениями в молекуле белка в результате его взаимодействия с наноразмерными объектами. Каталитические свойства полученного иммобилизованного препарата L-фенилаланин-аммоний-лиазы позволяют широко использовать его в биотехнологии.

Изобретение относится к биохимии. Предложен способ иммобилизации L-фенилаланин-аммоний-лиазы на магнитных наночастицах оксидов металлов в присутствии конденсирующего агента 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида. Способ позволяет повысить удельную активность L-фенилаланин-аммоний-лиазы и сохранить от 64% до 75% ее активности. 6 табл., 3 пр.

Способ иммобилизации L-фенилаланин-аммоний-лиазы на магнитных наночастицах, заключающийся в ковалентном связывании молекул фермента с поверхностью носителя посредством конденсирующего агента, отличающийся тем, что в качестве носителя для иммобилизации выступают наночастицы оксидов металлов, а в качестве конденсирующего агента используют 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид.