Способ определения активированных Т-лимфоцитов в крови Советский патент 1983 года по МПК G01N33/48 

(Л

с

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВИРОВАННЫХ Т-ЛИМФОЦИТОВ В КРОВИ, включаюои й их культивирование в питательной среде, введение колхицинаи пригото зление мазков, о f Д и J4 а ю щ и и с я тем, что, с целью повышения точности способа, культивирование проводят в течение 52156 ч, а колхицин вводят в крнцентр ии О 5 мкг/мл, после чего пррдолгжайт культивирование в течение 1,5-2 ч, затем -культуру центрифугируют, обрабатывают гипертоническим раствором, затем повторно центрифугируют ц. при до двух ассоциирующих акроцентрических хро,мосом в лимфои ите определяют. активированные Т-лимфоциты. .

о 1 х м со

Изобретение относится к медицине, а именно к иммуннологическим способам исследования и касается выявления в организме активированных лимфоцитов.

Известен способ определения активированных Т-лимфоцитов в крови, включающий их культивирование в питательной среде и приготовление мазков Cll.

Однако известный способ не обеспечивает высокой чувствительности и.точности.

Целью изобретения является повышение точности способа.

Цель достигается тем, что при, осуществлении способа активированных Т-лимфоцитов в крови, включающего их культивирование в питательной среде, введение колхицина и приготовление мазков,- культивирование проводят в течение 52-56 ч, а колхицин вводят в концентрации 0,5 мкг/мл, после чего продолжают культивирование в течение 1,5-2 ч-, затем культуру центрифугируют, обрабатывают гипертоническим раствором, затем повторно, центрифугируют и при наличии до двух ассоциирующих акроцентрических хромосом в лимфоците определяют активированные Т-лимфоциты.

Способ осуществляют следующим образом..

Ставят культуру лимфоцитов с добавлением фитогемагглютинина (ФГА)

Для постановки культуры у обследуемых людей берут кровь из вены или из пальца в пробирку с. гепарином (конечная концентрация гепарина 20 ед/мл). Кровь смешивают с питательной смесью 1:15. Питательная смесь состоит из среды 199, содержащей 10% человеческой резус-положительной сыворотки группы AB(IV) 100-200 ед/мл антибиотиков и 20 мкг/м ФГА. Всю работу по приготовлению культуры проводят стерильно, культуру инкубируют в термостате в течение 52-56 ч при , затем в нее добавляют колхицин (конечная концентрация колхицина в среде 0,5 мкг/мл). Инкубацию культуры с колхицином продолжают в течение 1,5-2 ч при том же режиме. В присутствии колхицина в.культуре накапливаются клетки в стадии метафазы. Так как колхицин разрушает клеточное веретено, последующие стадии митоза не наступают, а в стадии метафазы хромосомы наиболее.доступны для подробного морфологического изучения.

Прекращают инкубацию культуры . до 53-60 ч, когда лимфоциты делятся только первый раз, и частота ассоци 1аций акроцентрических хромосом в ни

соответствует таковой до введения их в культуру. После указанного часть лимфоцитов делится уже второй раз , и частота ассоциаций акро. центрических хромосом в них будет меньше исходной.

После инкубации культуры с колхицином взвесь клеток культуры цент- . рифугируют в течение 5-10 мин при

0 800-1000 об/мин, Надосадочную жид-г кость удаляют, а клеточный осадок подвергают гипотонической обработке, для чего на него наслаивают 0,56%-ный раствор хлористого калия,

5 осадок ресуспендируют в растворе и помещают в термостат при. на 5-10 мин. Затем клетки снова центрифугируют при том же режиме, надосадочную жидкостьудаляют, а клетки

0 фиксируют смесью метилового спирта и ледяной уксусной кислоты (соотношение спирта и кислоты 3:1), Фиксацию проводят следующим образом: на клеточный осадок наслаивают охлажденную до 4-8°С фиксирующую

смесь, клетки ресуспендируют в ней, и взвесь помещают на 15-20 мин в холодильник (температура 4-8 С). После экспозиции в холодильнике - взвесь центрифугируют при описанном.

выше режиме, надосадочную жидкость удаляют, а ф11ксацию клеток повторяют при том же режиме еще 2-3 раза.

После последней фиксации осадок клеток ресуспендируют в небольшом

5 количестве фиксирующей смеси (0,40,6 мл), и полученную взвесь наносят на обезжиренные и охлажденные

предметные стекла. Полученные препараты высушивают -и окрашивают по

0 Романовскрму-Гимза или ацето-орсеином. Окрашенные препараты иссле.дуют под микроскопом с иммерсией /(объектив X 90, окуляр х 10).Изу.чают лимфоциты, находящиеся в ста

5 дни метафазы, в которых псщсчитывают количество ассоциаций акроцентрических хромосом (ААХ). За ААХ принимают такое расположение , хромосом, когда они ориентированы

g друг к другу своими короткими пле-v чами и расстояние между ними не . более половины длинного плеча хро- ,мосомы D (большого акроцентрйка) или не более всего длинного плеча : хромосомы d (малого акроцентрйка).

У привитых вирусными вакцинами (оспенной, паротитной) и у больных гриппом в изученной клеточной популяции достоверно возрастало количество лимфоцитов с 0,2-tflst акро0 центрическими хромосомами и ассЬциг ации и соответственно уменьшалось ; количество лимфоцитов .с 4-мя и более хромосомами и ассоциации. КлеТ . ки с 3-мя акроцентрическими хромо5 -Сомами в ассоциации существенных .

личественных изменений не п зетерпевали, У привитых и у больных в ответ на антигенный раздражитель увеличивалось количество активно п ролиферирующих (размножающихся) Т-лимфоцитов с короткой интерфазой, т.е. количество активированшх лимфоцитов. К последним можно отнести лимфоциты с 0-2-мя акроцентрическими хромосомами э ассоциации,

Группы обследованных привитых были представлены детьми 1-2, 5-6 и 8 лет и подростками 15 лет, больные гриппом представлены взрослыми от 22 до 46 лет.

Увеличение количества активированных Т-лимфоцитов (содержат Oi2 акроцентрических хромосомы в ассоциации) , выявляемых по предлагае;мому способу, имело положительную корреляцию с приростом специфических антител и количеством антигеичувствифельных лимфоцитов у обслецованных, зато подтверждает достоверность способа. Несмотря на ТО| JTO антитела вырабатываются не Т-, а В-лимфоцитами, между этими вида ми клеток в процессе иммуногенеза существует тесная кооперация. Следовательно , лимфоциты, которые проходят первый цикл деления в культуре, стимулированной фитогемагглютинином, и содержит 0-2 акроцентри0ческие хромосоквы в одной ассоциации, можно считать активированными Т-лимфоцитами, образовавшимися .в организме после серии митозов под 8оздействием антигенов

5

Предлагаемый способ не требует для своей реализации дорогостоящей аппаратуры и дефицитных реактивов, позволяет среди- активированных лимфоцитов выявлять только Т-клетки.

Предлагаемый способ более чувст0вителен, так как позволяет более точно выявлять в организме активи(рованные лимфоциты.