Способ определения иммуноглобулинов человека Советский патент 1983 года по МПК A61K39/395 

1C

ел Изобретение относится к иммунохимии и может быть использовано для клинического анализа иммуноглобулинов (Yg) в биологических жидкостях. Известен способ радиальной иммунодиффузии, который основан на визуальном определении комплекса, образующегося при специфическом взаимодействии Yg из анализируемого образца с антителами против определяемого Yd в процессе диффузии реагентов в слое геля 1. Указанный метод обладает невысокой чувствительностью, длительным временем анализа (1 сут). Наиболее близким к предлагаемому является способ анализа Yg человека в сыворотке крови, который предусматривает инкубацию исследуемой сыворотки со специфическими антителами, иммобилизованными на сефарозе 2. Однако указанный метод трудоемок, его проведение включает две промывки иммуно сорбента, что занимает много времени и приводит к возрастанию ошибок измерения вследствие неизбежных потерь носителя при обмывке. Определение ферментативной активности проводят на носителе, чем усложняют процесс автоматизациии метода. Большой расход дорогостоящего меченого фермента приводит к высокой стоимости анализа, что осложняет проведение массовых обследований. Цель изобретения - упрощение способа и сокращение времени анализа. Указанная цель достигается тем, что при осуществлении способа определения иммуноглобулинов человека путем инкубации исследуемой сыворотки крови человека со специфическими антителами, иммобилизованными на нерастворимом носителе, инкубацию исследуемой сыворотки осуществляют со специфическими антителами, иммобилизованными на силохроме с размером частиц 30-40 мкм. Способ осуществляют следующим образом. Сыворотку крови человека инкубируют с иммобилизованными на силохроме специфическими антителами и ферментным коньюгатом, содержащим Yd, меченый пероксидазой. Н-а поверхности сорбента одновременно протекают две конкурирующие реакции: связывание антителами свободного Yg из сыворотки крови и Yg, меченного пероксидазой. После установления равнозесия в системе измеряют остаточную ферментативную активность надосадочной жидкости. Содержание, Yd в исследуемом образце определяют с помощью калибровочного графика, полученного при использовании стандартных препаратов Yd. Пример 1. Получение антител, иммобилизованных на силохроме. Используют сыворотку крови кроликов, иммунизированных очищенным препаратом Yg человека. Глобулиновую фракцию сыворотки крови выделяют двукратным осаждением 20%-ным водным раствором полиэтиленгликоля (м. в. 6000). Неорганический носитель силохром С-20 МК активируют кипячением в 2%-ном растворе -аминопропилтриэтоксилана в безводном толуоле. Аминированный силохром инкубируют с 1%-ным водным раствором глутарового альдегида. К 1 г активированного силохрома добавляют 60 мг глобулиновой фракции в-10 мл 0,01 М фосфатного буфера рН 7,4 с 0,1 м NaCI и 0,025% тритона X-305. Смесь инкубируют 3 ч, после чего сорбент трижды промывают фосфатным буфером и гомогенизируют до образования однородной суспензии. Сорбент хранят в 0,01 М фосфатном буфере рН 7,4, с 0,1 М NaCl при 4°С. В течение 10 мес антитела на сорбенте не теряют иммунологической активности. Получение комплекса IgG с пероксидазой. Используют коммерческий препарат TgG производства института им Н. Ф. Гамалеи и пероксидазу фирмы «Renal. Перед использованием фермент очищают до RZ-3 методами ионообменной хроматографии и гельфильтрации. Комплекс tgG-пероксидаза получают методом окисления углеводородного компонента фермента периодатом натрия. 5 мг пероксидазы растворяют в 1 мл 0,3 М бикарбоната натрия рН 8,1 и добавляют 0,1 мл 1%-ного раствора фтординитробензола в абсолютном этаноле. После инкубации 1 ч добавляют 1 мл 0,08 М раствора периодата натрия рН 6,2 и через 30 мин 1 мл 0,16 М раствора этиленгликоля в Boiie. Смесь инкубируют 1 ч и отдиализовывают при 4°С против 0,01 М карбонатного буфера рН 9,5. К раствору модифицированного фермента добавляют 10 мг IgG человека в 0,2 мл rpwc-HC буфере рН 8Ъ6. Смесь инкубируют 2,5 ч при комнатной температуре и добавляют 5 мг боргидрида натрия. Через 2 ч проводят диализ против 0,1М фосфатного буфера рН 7,4 с 0,1 м NaCl. Комплекс выделяют гель-фильтрацией на колонне с сефадексом С-200 (100x1,5 см), уравновешенным тем же буфером. Определение иммуноглобулина С (IgG) в сыворотке крови человека. В серию инкубационных пробирок дозиметрируют по 0,02 мл суспензии силохрома с размером частиц 30-40 мкм. С иммобилизованными антителами 0,1 м разведенной в 6000 раз измеряемой сыворотки и 0,1 мл комплекса IgG-пероксидазы (4,3 10 мол) Общий объем в пробирках доводят до 1 мл 0,01 М фосфатным буфером рН 7,4, содержащим 0,1 М NaCl и 0,025% тритона X-305. Смесь инкубируют при перемещивании 2,5 ч. Затем к 0,3 мл надосадочного раствора добавляют 0,05мл спиртового раствора о-дианизидина (), 0,3 мл буфера рН 2,7; 0,2 мл Н О (1,) и в течение 30 с измеряют начальную скорость ферментативной реакции на автоматическом анализаторе скоростей реакций. Пересчет начальной скорости в концентрацию измеряемого IgY производят по калибровочному графику, полученному со стандартным препаратом сыворотки крови, содержащим известное количество IgG (12,8 мг/мл). Пример 2. Получение комплекса IdA с пероксидазой, IgA выделяют из глобулиновой фракции сыворотки крови больного А-миеломой методами гель-хроматографии на С-200 и ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-сефадексе. Для получения комплекса IgA пероксидаза 6 мл фермента растворяют в 1 мл 0,3 М бикарбоната натрия РН 8,1) и добавляют 0,1 мл 1%-ного раствора фтординитробензола в абсолютном этаноле. Инкубируют I ч и добавляют 1 мл 0,08 М периодата натрия (рН 6,2). После 30 мин инкубации реакцию останавливают добавлением 1 мл 0,16 М этиленгликоля. Смесь инкубируют в течение 1 ч и диализуют против 0,01 М карбонатного буфера рН 95. К отдиализованному раствору добавляют 12 мг IgA в 0,2 мг трист-На буфере (рН 8,6) Инкубируют смесь 2,5 ч и диализуют при 4°С против 0,01 М фосфатного буфера рН 7, с 0,1 М NaCl. После диализа комплекс выделяют гель-фильтрацией на колонке с сефадексом С-200 (l,5lOO см), уравновешенном тем же буфером. Определение IgA в сыворотке крови человека. В серию инкубационных пробирок дозируют по 0,02 мл суспензии силохрома с иммобилизованными антителами, 0,1. мл комплекса 1 А-пероксидаза и 0,1 мл сыворотки, разведенной в 400 раз. Определение проводят по схеме, приведенной в примере 1. Таким образом, предлагаемый способ позволяет сократить время анализа, по сравнению с прототипом, в четыре раза, производить анализ в одну стадию, что приводит к снижению ошибки измерения, значительно облегчает действие оператора, увеличивает производительность. Способ предусматривает уменьшение расхода дефицитных и дорогостоящих реагентов. Например, наличие 1 г иммуносорбента на основе силохрома, содержащего 5 мг антител, дает возможность обследовать 3300 сывороток, при этом расходуется лишь 0,12 мг связанной с Ig-пероксидазы. Иммобилизованные на силохроме антитела используют для анализа в течение 1 года, а комплекс более 2 -х лет. Для проведения анализа клинической лаборатории не требуется особое оборудование, так как измерение ферментативной активности может осуществлять простейщим спектрофобометром, фотоэлектрокалориметром или по индикаторной шкале зависимости интенсивности окрашивания продукта фрементативной реакции от дозы определяемого Ig. Предлагаемый способ может найти широкое применение в клинической практике для проведения массовых анализов содержания Ig в сыворотке крови человека.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ ЧЕЛОВЕКА путем инкубации исследуемой сыворотки крови человека со специфическими антителами, иммобилизованными на нерастворимом носителе, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и сокращения времени, инкубацию исследуемой сыворотки осуществляют со специфическими антителами, иммобилизованными на силохроме с размером частиц 30-40 мкм.