СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА АЛЬФА-ФЕТОПРОТЕИН СУХОЙ Российский патент 2006 года по МПК A61K38/17 A61P37/02 

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается получения лиофилизированного препарата альфа-фетопротеина (АФП), относящегося к группе иммуномодуляторов и используемого в качестве средства для лечения онкологических, аутоиммунных и аллергических заболеваний.

АФП представляет собой фетальный гликопротеин с молекулярной массой около 70000 Д. АФП в большом количестве продуцируются клетками печени и брюшной стенки плода. Сырьем для получения АФП служит абортивная, пуповинная и плацентарная кровь, получаемая при медицинских абортах от клинически здоровых женщин, прошедших стандартное обследование. Получаемый абортивный материал обязательно тестируется на отсутствие антител к вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ) и на отсутствие вируса гепатита В и антител к вирусу гепатита С.

Применяют АФП преимущественно парентерально. Водные растворы АФП нестабильны в процессе хранения, поэтому задача получения высокостабильных лекарственных форм является актуальной. Наиболее эффективным способом стабилизации препаратов для целей длительного хранения является их лиофилизация с соответствующими добавками [5].

Онкофетальные белки получают из эмбриональной или опухолевой ткани человека или животных. Высокоочищенный АФП получают из абортивной крови методами аффинной хроматографии.

Известен способ получения АФП из опухолевой ткани человека, включающий выделение и хроматографическую очистку целевого продукта последовательно на нескольких сорбентах [2]. Его недостатком является высокая трудоемкость процесса и низкий выход целевого продукта.

Разработан способ получения АФП из эмбриональной ткани человека [1], включающий ее измельчение, помывку, обработку трипсином в течение 1 ч при температуре не более 37°С. Полученную суспензию клеток культивируют в питательной среде в течение 7-8 суток при 37°С, а целевой продукт отделяют центрифугированием при 3000 об/мин. Получают прозрачную жидкость оранжево-желтого цвета, содержащую 10% АФП.

Недостатками данного способа являются низкий выход и высокое содержание примесных белков.

Существует способ получения АФП из эмбриональной ткани человека [2], включающий обработку исходного материала бутиловым спиртом, центрифугирование, диализ водно-белковой фазы относительно 0,9%-ного раствора натрия хлорида, центрифугирование, инкубирование полученного супернатанта с эстрогеном в конечной концентрации 0,005% при температуре 0-10°С в течение 8 ч и выделение целевого продукта из супернатанта хроматографией на сефарозе CL-4B с иммобилизованным эстрогеном. Выход целевого продукта составляет 60-70%, а чистота препарата 90-95%.

Недостатками способа являются недостаточная чистота целевого продукта, наличие примеси альбумина и гемоглобина, а также высокая трудоемкость способа и необходимость работы с легковоспламеняющимся резко пахнущим органическим реактивом - бутиловым спиртом.

Одним из наиболее близких к изобретению является способ получения АФП из эмбриональной ткани человека 8-12 недель, полученной при медицинских абортах, включающий стадии [7]: измельчение и гомогенизация эмбриональной ткани; центрифугирование гомогената при 5000 об/мин; осветление супернатанта центрифугированием 12000 об/мин; очистка целевого продукта хроматографией на ДЕ-целлюлозе; очистка целевого продукта хроматографией на сефадексе G-100 с иммобилизованным на нем красителем цибакрон голубой F36-A; очистка целевого продукта рехроматографией на сефадексе G-100 с иммобилизованным на нем красителем цибакрон голубой F26-A; очистка целевого продукта хроматографией на ДЕ-целлюлозе.

Недостатками данного способа являются длительность процедуры, низкий выход (25-30%) и недостаточная чистота (85-90%) целевого продукта, высокая трудоемкость и необходимость в сложном аппаратурном оснащении (высокоскоростные центрифуги).

Ближайшим аналогом является способ получения сухого АФП [3], включающий операцию двойной афинной хроматографии на сефарозе, а также стадии стерилизующей фильтрации и лиофилизации.

Недостатками прототипа являются низкий выход (60-70%) и высокая контаминация примесными белками (чистота 90-95%) целевого продукта.

Технической задачей изобретения является увеличение выхода АФП и достижение максимальной чистоты целевого продукта.

Поставленная задача достигается следующим образом.

Проверенную на отсутствие вируса гепатита В, антител к ВИЧ, гепатиту С абортивную, пуповинную или плацентарную кровь или экстракт эмбриональных тканей очищают от примесных белков (в частности, иммуноглобулинов) путем фракционирования спиртом этиловым (5-30%) или сульфатом аммония или натрия (степень насыщения 30-40%), образовавшийся осадок центрифугируют. Супернатант диализуют относительно раствора натрия хлорида (0,15 моль/л) и подвергают стерилизующей фильтрации через каскад фильтров с размером пор от 3,0 до 0,22 микрона. В разведенную стерильную сыворотку добавляют натрия хлорид (0,1-1,0 моль/л) и тритон Х-100 (0,01-0,5%) для блокирования неспецифической сорбции и инактивации вирусов. Подготовленную таким образом стерильную сыворотку наносят на сорбент с иммобилизованными антителами к АФП. Неспецифически сорбировавшиеся компоненты крови вымывают с сорбента последовательно 4-5 объемами 0,15 М фосфатно-солевого буферного раствора рН 7,0-7,5, содержащего 0,5 М хлорида натрия, и таким же объемом раствора хлорида натрия (0,15 моль/л). Афинно-связанный АФП элюируют глицин-HCI буферным раствором (0,05-0,15 моль/л).

Элюат нейтрализуют до рН 6,0-8,0 и наносят на сорбент с иммобилизованными антителами против IgG человека, где происходит афинная сорбция человеческих иммуноглобулинов (негативная иммуносорбция), контаминирующих препарат после первой афинной очистки. Препарат, полученный после негативной иммуносорбции, разбавляют 0,9% раствором натрия хлорида и реополиглюкином до концентрации АФП 0,9 мг/мл и декстрана 10 мг/мл. После стерилизующей фильтрации субстанцию АФП лиофилизируют.

Существенными отличиями предлагаемого способа от прототипа являются предварительная очистка исходной сыворотки крови путем фракционирования белков сыворотки спиртом этиловым или сульфатами аммония или натрия, нанесение на аффинный сорбент в присутствии натрия хлорида и тритона Х-100 для подавления неспецифической сорбции и инактивации вирусов, элюция афинно связанного АФП с помощью глицин - HCl буферного раствора и доочистка препарата до гомогенного состояния на втором иммуносорбенте, представляющем собой сефарозу, модифицированную антителами против IgG человека.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1. Все процедуры проводят при +4°С. 3 л сыворотки крови центрифугируют со скоростью 3500 об/мин в течение 1 часа, осадок балластных веществ отбрасывают, а к 2,5 л супернатанта медленно прибавляют насыщенный раствор аммония сульфата до достижения 33% насыщения, инкубируют 1 час и центрифугируют при 2500 об/мин в течение 30 мин. 2 л супернатанта диализуют относительно раствора натрия хлорида (0,5 моль/л), разбавляют раствором натрия хлорида (0,5 моль/л) до 8 л, добавляют тритон X-100 до концентрации 0,01% и инкубируют с 1 л сефарозы CL-4B с иммобилизованными антителами к АФП. Инкубацию осуществляют в течение 48 ч при постоянном перемешивании.

Неспецифически сорбировавшиеся компоненты крови вымывают с сорбента последовательно 4-5 объемами фосфатно-солевого буферного раствора, содержащего 0,5 М натрия хлорида, и таким же количеством 0,15 М раствора натрия хлорида.

После отмывки сорбента раствором натрия хлорида (0,15 моль/л) проводят элюцию 0,1 М глицин-HCl буферным раствором с рН 2,5. Процесс элюции контролируют по оптической плотности при длине волны 280 нм. Элюцию проводят до достижения нулевых значений оптической плотности. Элюат, содержащий целевой продукт, нейтрализуют до рН 6,5-7,5 и наносят на колонку с сефарозой CL-4B с иммобилизованными антителами против IgG человека.

Полученный препарат, содержащий АФП, очищенный от глобулинов, альбумина и других примесных белков, диализуют относительно раствора натрия хлорида (0,15 моль/л), разбавляют реополиглюкином до концентрации АФП 0,9 мг/мл и декстрана 10 мг/мл.

После стерилизующей фильтрации раствор АФП разливают в ампулы по 1 мл, лиофилизируют и хранят при +4°С. Электрофоретическая чистота полученного препарата анализируется методом электрофореза в градиенте полиакриламидного геля. Чистота полученного препарата более 98%. Выход препарата составляет 75%. Полученный препарат тестируют на отсутствие антител к ВИЧ, вируса гепатита В и антител к вирусу гепатита С. Препарат стерилен, не содержит пирогенных и токсических примесей.

Пример 2. Все процедуры проводятся при +4°С. 3 л сыворотки крови центрифугируют со скоростью 2500 об/мин в течение 1 ч, осадок балластных веществ отбрасывают, а к 2,5 л супернатанта медленно прибавляют насыщенный раствор аммония сульфата до достижения 33% насыщения, инкубируют 1 ч и центрифугируют при 2500 об/мин в течение 30 мин. 2 л супернатанта диализуют относительно раствора натрия хлорида (0,5 моль/л), разбавляют раствором натрия хлорида (0,5 моль/л) до 8 л, добавляют тритон X-100 до концентрации 0,01% и наносят на хроматографическую колонку, заполненную 1 л сефарозы 4B-CL с иммобилизованными антителами к АФП. Скорость нанесения 320 мл/ч. Нанесение осуществляется трехкратным прохождением наносимого объема через колонку.

Неспецифически сорбировавшиеся компоненты крови вымывают с сорбента последовательно фосфатно-солевым буферным раствором, содержащим 0,5 М натрия хлорида, и 0,15 М раствором натрия хлорида со скоростью 300 мл/ч до достижения нулевых значений оптической плотности.

После отмывки сорбента раствором натрия хлорида (0,15 моль/л) проводят элюцию 0,1 М глицин-НС буферным раствором с рН 2,5 и скоростью 150 мл/ч. Процесс элюции контролируют по оптической плотности при длине волны 280 нм. Элюция проводится до достижения нулевых значений оптической плотности. Элюат, содержащий целевой продукт, нейтрализуют до рН 6,5-7,5 и наносят на хроматографическую колонку с сефарозой CL-4B с иммобилизованными антителами к IgG человека. Скорость нанесения 80 мл/ч.

Весь прошедший через колонку раствор, содержащий АФП, очищенный от глобулинов, альбумина и других примесных белков, диализуют относительно раствора натрия хлорида (0,15 моль/л) и разбавляют реополиглюкином до концентрации АФП 0,9 мг/мл и декстрана 10 мг/мл.

После стерилизующей фильтрации раствор АФП разливают в ампулы по 1 мл, лиофилизируют и хранят при +4°С. Электрофоретическую чистоту полученного препарата АФП проверяют методом электрофореза в градиенте полиакриламидного геля. Чистота полученного препарата более 98%. Выход препарата составляет 75%. Полученный препарат тестируют на отсутствие антител к ВИЧ, вируса гепатита В и антител к вирусу гепатита С. Препарат стерилен, не содержит пирогенных и токсических примесей.

Пример 3. Все процедуры проводятся при +4°С. 3 л сыворотки крови центрифугируют со скоростью 3500 об/мин в течение 1 часа, осадок балластных веществ отбрасывают, а к 2,5 л супернатанта медленно прибавляют насыщенный раствор аммония сульфата до достижения 33% насыщения, инкубируют 1 час и центрифугируют при 2500 об/мин в течение 30 мин. 2 л супернатанта диализуют относительно раствора натрия хлорида (0,15 моль/л), доводят раствор натрия хлорида до концентрации 0,1 моль/л, добавляют тритон Х-100 до концентрации 0,01% и инкубируют с 1 л сефарозы CL-4B с иммобилизованными антителами к АФП. Инкубацию осуществляют в течение 48 ч при постоянном перемешивании.

Неспецифически сорбировавшиеся компоненты крови вымывают с сорбента последовательно 4-5 объемами фосфатно-солевого буферного раствора, содержащего 0,5 М натрия хлорида, и таким же количеством 0,15 М раствора натрия хлорида.

После отмывки сорбента раствором натрия хлорида (0,15 моль/л) проводят элюцию 0,1 М глицин-HCl буферным раствором с рН 2,5. Процесс элюции контролируют по оптической плотности при длине волны 280 нм. Элюция проводится до достижения нулевых значений оптической плотности. Элюат, содержащий целевой продукт, нейтрализуют до рН 6,5-7,5 и наносят на колонку с сефарозой CL-4B с иммобилизованными антителами против IgG человека.

Полученный препарат, содержащий АФП, очищенный от глобулинов, альбумина и других примесных белков, диализуют относительно раствора натрия хлорида (0,15 моль/л), разбавляют реополиглюкином до концентрации АФП 0,9 мг/мл и декстрана 10 мг/мл.

После стерилизующей фильтрации раствор АФП разливают в ампулы по 1 мл, лиофилизируют и хранят при +4°С. Электрофоретическая чистота полученного препарата анализируется методом электрофореза в градиенте полиакриламидного геля. Чистота полученного препарата более 98%. Выход препарата составляет 75%. Полученный препарат тестируют на отсутствие антител к ВИЧ, вируса гепатита В и антител к вирусу гепатита С. Препарат стерилен, не содержит пирогенных и токсических примесей.

Пример 4. Все процедуры проводятся при +4°С. 3 л сыворотки крови центрифугируют со скоростью 3500 об/мин в течение 1 часа, осадок балластных веществ отбрасывают, а к 2,5 л супернатанта медленно прибавляют насыщенный раствор аммония сульфата до достижения 33% насыщения, инкубируют 1 час и центрифугируют при 2500 об/мин в течение 30 мин. 2 л супернатанта диализуют относительно раствора натрия хлорида (0,15 моль/л), доводят раствор натрия хлорида до концентрации 1,0 моль/л, добавляют тритон Х-100 до концентрации 0,5% и инкубируют с 1 л сефарозы CL-4B с иммобилизованными антителами к АФП. Инкубацию осуществляют в течение 48 ч при постоянном перемешивании.

Неспецифически сорбировавшиеся компоненты крови вымывают с сорбента последовательно 4-5 объемами фосфатно-солевого буферного раствора, содержащего 0,5 М натрия хлорида, и таким же количеством 0,15 М раствора натрия хлорида.

После отмывки сорбента раствором натрия хлорида (0,15 моль/л) проводят элюцию 0,1 М глицин-HCl буферным раствором с рН 2,5. Процесс элюции контролируют по оптической плотности при длине волны 280 нм. Элюция проводится до достижения нулевых значений оптической плотности. Элюат, содержащий целевой продукт, нейтрализуют до рН 6,5-7,5 и наносят на колонку с сефарозой CL-4B с иммобилизированными антителами против IgG человека.

Полученный препарат, содержащий АФП, очищенный от глобулинов, альбумина и других примесных белков, диализуют относительно раствора натрия хлорида (0,15 моль/л), разбавляют реополиглюкином до концентрации АФП 0,9 мг/мл и декстрана 10 мг/мл.

После стерилизующей фильтрации раствор АФП разливают в ампулы по 1 мл, лиофилизируют и хранят при +4°С. Электрофоретическая чистота полученного препарата анализируется методом электрофореза в градиенте полиакриламидного геля. Чистота полученного препарата более 98%. Выход препарата составляет 75%. Полученный препарат тестируется на отсутствие антител к ВИЧ, вируса гепатита В и антител к вирусу гепатита С. Препарат стерилен, не содержит пирогенных и токсических примесей.

Использование предлагаемого способа позволяет по сравнению с прототипом:

- повысить чистоту целевого продукта за счет предварительного фракционирования белков исходной сыворотки крови и двойной афинной хроматографии на сорбентах высокой специфичности;

- увеличить выход АФП с афинного сорбента с иммобилизованными антителами к АФП благодаря применению глицин-HCl буферного раствора;

- сократить время полного технологического цикла за счет отсутствия стадии гель-фильтрации.

Источники информации

1. А.с. №403407, кл³ А 61 К 35/48 Способ получения биостимулятора; заявл. 26.11.68; опубл. 26.10.73.

2. А.с. №1497806 СССР, МКИ⁴ А 61 К 37/02. Способ получения альфа-фетопротеина.

3. Патент РФ №2100031 Способ получения альфа-фетопротеина. В.В.Стариков, С.Ю.Родионов, Мягкоходов В.А., Пак Н.А. Опубл. 27.12.97; бюл. №36.

4. Патент РФ №2121350 Способ получения препарата альфа-фетопротеина. В.В.Стариков, С.Ю.Родионов, Мягкоходов В.А., Решетников С.С., Пак Н.А. Опубл. 10.11.98 г., бюл. №31.

5. Никитин В.В., Звягин И.В. Замораживание и высушивание биологических препаратов. М.: Колос, 1971, 344 с.

6. Gold Phil et all. Physicochemical Approach to the Purification of Human Fetoprotein from the Ascites Fluid of a Hepatoma-bearning" Patient. Cancer research. 1978, - №36, - р.6-12.

7. Huse Klaus et all. A novel purification procedure for human fetoproteun by application of immobilized Cibacron Blu F36-A as affinity ligand Clinica Chimica Acta, 133, 1983, 335-340.

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности. Альфа-фетопротеин (АФП) сухой выделяют из сыворотки крови. Проводят фракционирование белков этиловым спиртом, или сульфатом аммония, или сульфатом натрия. После отделения супернатанта его диализуют относительно раствора хлорида натрия. Нанесение на аффинный сорбент проводят в растворе натрия хлорида 0,1-1,0 моль/л и тритона Х-100 0,01-0,5%. Афинно-связанный АФП после промывки сорбента фосфатно-солевым буфером элюируют с помощью глицин-HCl буферного раствора. Элюат нейтрализуют и наносят на второй аффинный сорбент, в качестве которого используют сефарозу с антителами против IgG человека. Проводят стерилизующую фильтрацию и лиофилизацию. Изобретение позволяет повысить выход АФП и его чистоту.

Способ получения препарата альфа-фетопротеин сухой путем выделения из сыворотки крови и очистки с помощью двойной аффинной хроматографии на сефарозе, стерилизующей фильтрации и лиофилизации, отличающийся тем, что до хроматографической очистки проводят фракционирование белков этиловым спиртом, или сульфатом аммония, или сульфатом натрия, после отделения супернатанта его диализуют относительно раствора хлорида натрия, нанесение на аффинный сорбент проводят в растворе натрия хлорида 0,1-1,0 моль/л и тритона Х-100 0,01-0,5%, аффинно-связанный АФП после промывки сорбента фосфатно-солевым буфером элюируют с помощью глицин-HCl буферного раствора, элюат нейтрализуют и наносят на второй аффинный сорбент, в качестве которого используют сефарозу с антителами против IgG человека.