Способ получения фаголизосомальных структур фагоцитирующих клеток Советский патент 1985 года по МПК G01N33/48 

00

00

СХ) Изобретение относится кбиохими и может быть использовано для полу чения внутриклеточных органелл. Известен способ получения фаголиэосомальных структур фагоцитирующих клеток путем получения клеток смешивания их с инкубационной средой, содержащей фагоцитируемый материал, проведения фагоцитоза с последующим разрушением клеток и в делением фаголизосомальных структур н, .Однако известный способ не позволяет получать в достаточном количестве высокоочищенные препараты Целью изобретения является повы шение чистоты и выхода целевого пр дукта. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получени фаголизосомальных структур фаго.цитирующих клеток путем .получения клеток, смешивания их с инкубационной средой, содержаь ей фагоцитируемый материал, проведения фаго цитоза с последующим разрушением клеток -и выделением фаголизосомаль ных структур, в качестве фагоцитируемого материала используют части цы карбонального железа диаметром 1-5 мкм в количестве 20-50 мг на 100-10 фагоцитирующих клеток с по ледующим отделением фаголизосомаль ных структур из разрушенных клеток в постоянном магнитном поле с напряженностью 400-1000 Э. Пример, Фагоциты получал промыванием брюшной полости мышей СВА средой Игла с 0,2%-ным быч им сывороточным альбумином и 20 ед гепарина/мл. Клетки осаждали центрифугированием в течение 8 мин при 1200 об/мин при 4°с;после зтого осадок ресуспендировали в этой же среде без гепарина и внов центрифугировали в том же режиме. Монослой клеток получали путем их инкубации при 37°С в течение 60 ми в атмосфере 5% СО в среде Игла, содержащей 5% инактивирсванной телячьей эмбриональной сыворотки и 10 мМ HEPES (рн 7,2). Неприлипшие клетки удаляли 3-кратным промыванием монослоя раствором Хенкса, количество прилипших клеток определяли на инвертированном микроскопе, к монослою клеток добавляли карбониальное железо, опсонизированное нормальной мышиной сыворот кой, из расчета 34 мг на 10010 клеток. Фагоцитоз проводили в течение 60 мин при 37°С в атмосфере 5% СО в вышеназванной среде. Нефагоцитированные частицы карбонильного железа удаляли З-кратньам промыванием монослоя клеток раствором Хенкса,клетки, снимали с чашек кисточкой, осаждали при 1200 об/мин в течение 8 мин при t 0-4°С, ресуспендировали в среде выделения, содержащей 0,25 М сахарозу и 10 мМ HEPES (рН 7,2) и разрушали в гомогенизаторе . Полученный гомогенат с помощью перистальтического насоса пропус- кали в магнитном поле, задержанный на магните материал промывали средой выделения, собирали и подвергали энзимологическому анализу. Напряженность магнитного поля составляла 400 Э. Исследовались активности 5-нуклеотидазы (маркер плазматической мембраны), кислой фосфатазы(лизосомальный маркер) и лактатдегидрогеназы (маркер цитозода). Полученные данные представлены, в таблице. Представленные данные указывают, что предложенные процедуры позволяютВ один этап в магнитном поле-получать фракцию, обладающую специфической ферментативной активностью маркеров плазматической мембраны и лизосом, более чем в 10 раз превышаюшую эту активность в исходном гомогенате. Это свидетельствует о том, что получаемая в магнитном поле фракция представляет собой фаголизосомальные структуры фагоцитирующих клеток. По активности же лактатдегидрогеназы одного из ферментов, протекающего в Цитозоле гликолиза, можно судить о загрязненности выделяемых структур неразрушенными фагоцитами, В пересчете на общую активность такое загрязнение составляет меньше 1%. Использование способа позволяет значительно повысить чистоту получаемых фаголизосомальных структур, В предлагаемом способе загрязнение составляет меньше 1%, тогда как в известном оно достигает 5%. Возрастает количество получаемых фаголизосомальных структур, так как им придаются специальные характеристики, коренным образом отличающие их от других клеточных органелл. Кроме того, упрощается весь процесс , ёыделения,который представляет в предлагаемом способе только деление атериала в магнитном поле.

5-Нуклеотидаза Кислая фосфатаза

Лактатдегидрогеназа

7,8810,94

10,6 3,10tO,47 11,0

3,,04

0,17

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФАГОЛИЗОСОМАЛЬНЫХ СТРУКТУР ФАГОЦИТИРЛОЩИХ КЛЕТОК путем получения клеток,смешивания их с инкубационной средой, содержащей фагоцитируемый материал. проведения фагоцитоза с последующим разрушением клеток и выделением фаголизосомальных структур, о т личагощийся тем, что, с целью повышения чистоты и выхода целевого продукта, в качестве фагоцитируемого материала используют частицы карбонильного железа диаметром 1-5 мкм в количестве 20-50 мг на 100Ю фагоцитирующих клеток с последующим отделением фаголизосомальных структур из разрушенных клеток в постоянном магнитном поле с напряженностью 400-1000 Э.

5-Нуклеотидаза и кислая фосфатаза даны лактатдегидрогеназа в Фе/мг. в мкМ Р /ч мг;