Способ количественного определения коэнзима А в лейкоцитах Советский патент 1983 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к биологии и медицине и может С)ыть использовано при экспериментальных и клинических исследованиях для определения коэнзима А.

Известен способ количественного определения коэнзима А (коА) в тканях (лейкоцитах) путем проведения реакции ацетилирования с использованием П-аминобензойной кислоты (ПАБК) с последующим внесением реагента для определения продуктов ацетилирования, по количеству которых определяют количественное содержание коэнзима Cl.

Однако известный способ не является достаточно точным вследствие недостаточной интенсивности реакции ацетилирования нативными лейкоцитами и развития у них дополнительной окраски для определения продуктов ацетилирования.

Цель изобретения - повышение точности способа количественного определения (КоА) в лейкоцитах.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу количественного определения КоА в лейкоцитах, рключающему проведение реакции ацетилировани с использованием п-аминобензойной кислоты с последующим внесением реагента для определения продуктов ацети дирования, по количеству которых определяют количественное содержание КоА, предварительно до проведения реакции ацетилирования лейкоциты кипятят с водой, с образовавшимся экст-; рдктом проводят реакцию ацетилирова-s ния путем дополнительного внесения ацетонового порошка печени, а в качестве реагент для определения продукта ацетилирования используют Т -диметилбенз альдегид.

Способ осуществляют следующим образом.

К 5 мл венозной крови добавляют 1 каплю раствора гепарина (1 ME/мл/ и 1,25 ьш 6%-ного раствора среднемолекулярного подиглюкина, осторожно перемешивают и помещают в стакан со льдом на 1-1,5 ч. Плазма со взвешенными в ней лейкоцитами отсасывается пипеткой и после подсчета количества форменных элементов центрифугируется на холоде при ЗрОО об/мин в течение 15 мин, К осгшку лейкоцитов приливают 1 мл дистиллированной воды, растирают стеклянной палочкой и кипятят на водяной бане 7-8 мин. Полученный экстракт охлаждается, .центрифугируется, и в количестве 0,25-0,5 мл используется для анализа КоА.

В стеклянную пробирку помещают 0,25-0,5 мл прозрачного лейколизата/ 0,2-0,5 мл инкубаидюнной смеси, 0,3 мл ацетилирующей смеси, содержащей 2 мл 0,004 М раствора ПАБК, 1,6 мл 0,05 М раствора АТФ, 0,5 мл

1 М раствора ацетата натрия, 2 мл 0,2 М раствора цитрата натрия.0,1 мл М раствора солянокислого цистеина и 0,1 мл 1 М свежеприготовленного раствора бикарбоната натрия и 0,25-0,5 мл 10%-ного раствора ацетонового порошка печени в 0,02 М растворе бикарбоната натрия.

Содержимое пробирки тщательно перемешивается и инкубируется 1 ч при . Реакция останавливается добавлением 1 мл 15% раствора трихлоруксусной кислоты, пробы центрифугируются 15 мин при 3000 об/мин.

К 0,5 мл центрифугата добавляют 1 мл воды и 0,5 мл 5 н.раствора соляной кислоты. Вносят 2 мл свежеприготовленного 2% спиртового раствора п-диметиламинобензальдегида. Пробы через 15 мин колориметрируются при 453: нм, кювета 5 мм. Количество свободной ПАБК в исследуемых пробах определяется по калибровочной кривой, В качестве контроля используются пробы, в которых трихлоруксусная кислота вносится перед инкубацией.

В каждой отдельной пробе рассчитывается количество ацетилированной ПАБК Iразница между контролем и опытом ) в мкг на. 1 млн. лейкоцитов за 1 ч инкубации. При наличии образца КоА ацетилирующая активность выражается в нг КоА на 1 млн лейкоцитов .

Пример. Для определения возможности использования способа как критерия оценки обеспеченности организма человека пантотеновой кислотой обследовали 4 группы лиц: 1-я - здоровые доноры, получающие обычное сбалансированное питание, 2-я - здоровые доноры, получающие, обычное питание и однократную энтеральную нагрузку 200 мг пантотената кальция,: 3-яздоровые доноры, получающие обычное

питание и однократную парентеральную нагрузку 200 мг пантотената кальция, 4-я - больные хроническим алкоголиз;мом, характеризующихся вторичной |( эндогенной ) недостаточностью пантотеновой кислоты.

В качестве критерия достоверности метода избраны соответствие изменений уровня КоА в лейкоцитах характеру обеспеченности организма пантотенойой кислотой и соответствие изменений показателя суммарному содержанию микробиологически определяемых форм пантотената в экстракте лейко- . цитов.

В таблице приводятся результаты исследования.

Представленные данные подтверждают с1декватность реакции уровня КоА в лейкоцитах состоянию обеспеченности

организма пантотеновой кислотой и j прямо коррелируют с содержанием микробиологически оп еделяемых форм витамина в лейкоцитах.

Предлагаемый способ определения. коэнзима А прост,надежен,позволяет определить содержание КоА в лейкоцитах с высокой точностью и в короткий срок.

1 2

20 Ю 12 0

3

4

13,2±3,766,1+3,389,4±4,9

166,5+6,9150,3±6,2179,6+7,7

153,9±7139,2+6,4168,8±7,8

28,3+1,525,±1,534,6±1,35