НАБОР РЕАКТИВОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПЕРВИЧНЫХ АРОМАТИЧЕСКИХ АМИНОВ В РАСТВОРАХ И БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ Российский патент 1997 года по МПК G01N33/48 A61B19/02 

Изобретение относится к методам определения химических веществ в растворах и биологических жидкостях.

Известно, что выполнение любой методики количественного определения веществ состоит из двух основных этапов: приготовления растворов веществ, необходимых для определения и серии последовательных операций в соответствии с методикой.

Выполнение первой части весьма трудоемко, требует особо точных измерений и высокой квалификации от исполнителя, что может осуществляться ни в каждой производственной и исследовательской лаборатории.

Вместе с тем, от качества выполнения этой работы во многом зависит конечный результат анализа, поэтому для многих широко используемых методик биохимического анализа соответствующие реактивы изготавливаются в специализированных лабораториях и продаются в виде наборов. Такие наборы существуют в продаже для определения ряда веществ в крови с целью диагностики при обследовании больных. Такие наборы имеются для определения общего белка, сахара, холестерина, мочевины, кальция, фосфора, железа.

Вместе с тем, имеется еще много методик, используемых в клинической биохимии, для которых не существует соответствующих наборов реактивов, что значительно затрудняет и замедляет обследование больных, снижает точность и сопоставимость получаемых результатов. Это особенно негативно сказывается при определении показателей, используемых в качестве генетических маркеров, поскольку при этом необходимы массовые популяционные обследования в различных регионах при хорошей сопоставимости результатов. К таким тестам относится и определение N-ацетилтрансферазной активности (КФ 2.3.1.5; N-AT). Она определяется по степени ацетилирования сульфадимезина и некоторых других сульфаниламидов.

Количественное определение сульфаниламидов необходимо и в других случаях, связанное с их применением в лечебных целях. Данная методика может быть использована и для определения других первичных ароматических аминов, применяемых в различных областях народного хозяйства и оказывающих воздействие на организм человека.

Известен метод определения сульфаниламидлов и первичных ароматических аминов, который используется при выявлении N АТ активности (Буловская Л.Н. Борисенко Г. Н. Дробаченко О.А. Определение фенотипа N-ацетилтрансферазной активности. Лабораторное дело, 1989, N 10, с.28 30).

Для определения по этому методу приготовляют следующие растворы: 20% трихлоруксусная кислота (ТХУ), 0,2% натрий азотистокислый (свежеприготовленный! ), 0,1% аммоний сульфвминовокислый и 0,1% N-(I)-нафтилэтилендиаминодигидрохлорид (НЭД) и стандартный раствор анализируемого вещества в концентрации 180 мкмоль/л.

Приготовленные растворы используют в следующем порядке в ходе определения: к 0,1 мл цельной крови, сыворотки или другой исследуемой жидкости приливают 1,4 мл дистиллированной воды и 0,5 мл 20% трихлоруксусной кислоты для осаждения белков. Пробы центрифугируют. В центрифугате определяют путем диазотирования натрием азотистокислым и азосочетания с N-(I)-нафтилэтилендиаминодигидрохлоридом сульфаниламиды или другие ароматические амины, которые содержались в пробе.

Однако комплектование реактивов для этой методики затруднено тем, что требует объединения разнообразных дефицитных реактивов, основной реагент НЭД импортируется, а аммоний сульфаминовокислый изготавливается по заказу.

Целью изобретения является повышение точности метода, стандартизация, унификация, упрощение, что достигается путем комплектования набора реактивов с соответствующей инструкцией их использования для количественного определения сульфаниламидов и других первичных ароматических аминов. Набор содержит в соответствующих упаковках: навеску трихлоруксусной кислоты (ТХУ), которая при растворении в 50 мл дистиллированной воды дает раствор, осаждающий белки; полоски бумаги с натрием азотистокислым, приспособленные для получения раствора диазотирования непосредственно перед определением (ex tempore); навеску аммония сульфаминовокислого, которая при растворении в 25 мл дистиллированной воды дает раствор для связывания избытка натрия азотистокислого; раствор N-(I)-нафтилэтилендиаминодигидрохлорида (NЭД) для получения окрашенного азосоединения; полоски бумаги, содержащие 0,018 мкмоль стандартного анализируемого амина.

Авторы впервые предлагают комплектование набора реактивов для определения в растворах, биологических жидкостях соединений, относящихся к первичным ароматическим аминам.

Полный комплект реактивов освобождает от необходимости поиска дефицитных реактивов: N-(I)-нафтилэтилендиаминодигидрохлорида и аммония сульфаминовокислого, полностью исключает взвешивание реактивов. Используя предлагаемый набор реактивов, легко приготавливают необходимые растворы, добавляя известные объемы дистиллированной воды по инструкции.

Приготовленные растворы хранятся в холодильнике 4^oC и используются для последующих определений, кроме того, наличие в наборе полосок хроматографической бумаги с известным содержанием стандартов и натрия азотистокислого полностью исключает не только их отвешивание в день опыта, но и напрасный расход реактивов по известному способу, когда неиспользованный остаток, растворенного нитрита и стандарта не может быть повторно использован и выливается. Нанесенные же на бумажку и высушенные они хранятся длительно. Уменьшение объемов в известном способе ведет к потере точности приготовления раствора из-за малых количеств взвешиваемого вещества.

Авторы полностью описывают приготовление реактивов, ход определения и расчет результатов в прилагаемой к набору инструкции. Набор рассчитан на 100 определений. Результаты при определении с использованием набора имеют прекрасные совпадения в параллельных пробах, хорошую воспроизводимость метода и соответствие результатам при известном исследовании. Набор компактен, удобен для перевозок, что значительно расширяет и облегчает возможности его использования в лабораториях, различных по оснащению, и особенно при массовых популяционных исследованиях.

Набор состоит из пяти флаконов, содержащих следующие компоненты:
Флакон N 1 трихлоруксусная кислота (10 г)
Флакон N 2 полоски хроматографической бумаги, содержащие 4 мг нитрита натрия
Флакон N 3 аммоний сульфаминовокислый (250 мг)
Флакон N 4 раствор N-(I)-нафтилэтилендиаминодигидрохлорида (4 мл 0,1%)
Флакон N 5 полоски хроматографической бумаги, содержащие определяемый сульфаниламид или другой ароматический амин в дозе 0,0180 мкмоль.

Реактивы после их неполного использования хранятся в холодильнике.

Определение сульфаниламидов и первичных ароматических аминов согласно инструкции, прилагаемой к набору, осуществляется следующим образом:
Приготовление реактивов из набора:
Содержимое флакона N 1 растворяем количественно в 50 мл дистиллированной воды.

Содержимое флакона N 3 растворяем в 25 мл дистиллированной воды.

1 мл раствора (NЭД) из флакона N 4 разводим в 10 раз.

Бумажки со стандартными дозами испытуемого вещества измельчают и экстрагируют дистиллированной водой в объеме 1,5 мл.

Ход определения.

К пробе с исследуемым материалом добавляем до 1,5 мл дистиллированной воды, приливаем 0,5 мл 20% ТХУ и центрифугируем 20 мин 3000 об/мин. К 0,5 мл центрифугата приливаем 0,1 мл 4 н. соляной кислоты. (В состав набора не входит, т. к. имеется в каждой лаборатории). Пробы охлаждаются в течение 30 мин при 4^oC. В этот период полоска с нитритом из флакона N 2 измельчается и экстрагируется в объеме 2 мл дистиллированной воды. 0,1 мл этого раствора используется для диазотирования охлажденной пробы в течение 4 мин. Избыток нитрита натрия связывается 0,1 мл 1% аммония сульфаминовокислого. Для получения окрашенного азопроизводного через 2 мин прибавляют 0,2 мл NЭД. Полоски со стандартом анализируемого вещества измельчаются и приливается 1,5 мл дистиллированной воды, 0,5 мл 20% ТХУ. Дальнейшее определение стандартного раствора проводилось в 0,5 мл центрифугата аналогично, как описано для исследуемых растворов. После прибавления NЭД стандартные и анализируемые пробы оставляются на один час в темноте и фотометрируются на фотоэлектроколориметре при длине волны 540 нм при толщине слоя 1 см против контрольной пробы на реактивы.

Для определения ацетилированных производных первичных ароматических аминов необходимо проводить гидролиз после добавления соляной кислоты в течение 45 мин на кипящей водяной бане.

Результаты рассчитывают по формуле:

где C концентрация анализируемого амина, ммоль/л;
D_оп и D_ст оптические плотности опытной и стандартной проб;
0,180 ммоль/л концентрация стандартного раствора.

Пример 1. Определение сульфадимезина в растворе.

Приготовляют, как описано в инструкции, к набору реактивы. К 0,1 мл анализируемого раствора сульфадимезина приливают 1,4 мл дистиллированной воды и 0,5 мл 20% ТХУ. Перемешивают, центрифугируют. К 0,5 мл центрифугата приливают по 0,1 мл 4 н. соляной кислоты, охлаждают 30 мин 4^oC. В это время полоску с нитритом натрия измельчают и приливают к ней 2,0 мл дистиллированной воды. К охлажденным пробам приливают 0,1 мл раствора нитрита натрия для диазотирования. Через 4 мин приливают 0,1 мл аммония сульфаминовокислого, связывая избыток нитрита натрия и через 2 мин приливают 0,2 мл раствора NЭД, разведенного в 10 раз. Пробы помещают в темноту на час. Фотометрируют при длине волны 540 нм, с толщиной слоя 1 см. Полоску со стандартной дозой сульфадимезина (СД) 0,018 мкмоль измельчают, экстрагируют в 1,5 мл воды, приливают 0,5 мл ТХУ и далее определение проводят аналогично анализируемому веществу. Концентрация сульфадимезина составила 0,179±0,005 ммоль/л, что соответствует действительности, так как анализируемый раствор сульфадимезина был приготовлен растворением 5 мг в 100 мл (0,180 ммоль/л).

Параллельно проводили определение концентрации сульфадимезина известным методом. Данные эксперимента приведены в таблице.

Пример 2. Определение СД в сыворотке крови.

Реактивы приготовляют согласно инструкции. К 0,1 мл сыворотки приливают 1,4 мл дистиллированной воды, 0,5 мл ТХУ. Пробы центрифугируют 30 мин 3000 об/мин. Центрифугат разливают по 0,5 мл в две пробирки, приливают по 0,1 мл 4 н. соляной кислоты. Одну из пробирок гидролизуют 45 мин на кипящей водяной бане. Все пробирки помещают на 30 мин в холодильник 4^oC. После чего диазотируют 4 мин с 0,1 мл раствора натрия азотистокислого, приготовленного по инструкции из набора. Затем приливают 0,1 мл аммония сульфаминовокислого и через 2 мин по 0,2 мл раствора NЭД. Стандартные пробы сульфадимезина готовят аналогично, используя полоски со стандартной дозой сульфадимезина 0,018 мкмоль. Пробы помещают в темноту на один час и фотометрируют при длине волны 540 нм.

В негидролизованных пробах определяют концентрацию свободного сульфадимезина в сыворотке в ммоль/л. Расчет концентрации осуществляется по формуле:

Оптические плотности параллельных негидролизованных проб анализируемой сыворотки: 0,198; 0,180; 0,240, в среднем 0,194±0,008 ммоль/л. Оптическая плотность стандарта сульфадимезина 0,179. Концентрация свободного сульфадимезина в сыворотке при расчете составила 0,195±0,008.

В гидролизованных пробах определяют концентрацию общего (ацетилированного и свободного) сульфадимезина в сыворотке крови обследуемого. Оптическая плотность гидролизованных проб составила: 0,311; 0,310; 0,325, в среднем 0,315±0,005, при оптической плотности стандарта 0,179. Концентрация общего сульфадимезина в сыворотке при расчете равнялась 0,317±0,005 ммоль/л.

Пример 3. Определение концентрации парааминобензойной кислоты (ПАБК) в растворе.

Анализируемый раствор ПАБК приготовлен растворением навески 1,37 мг в 100 мл, концентрация 0,100 ммоль/л.

Реактивы из набора готовят аналогично первым примером. К 0,1 мл анализируемого раствора ПАБК приливают 1,4 мл дистиллированной воды, 0,5 мл ТХУ. В центрифугате определяют концентрацию ПАБК по инструкции к набору.

В качестве стандарта служат полоски из набора, содержащие по 0,018 мкмоль парааминобензойной кислоты.

Концентрация анализируемого раствора составила 0,100±0,004, что соответствует действительности.

Для сопоставления концентрацию ПАБК в анализируемом растворе определяли и известным методом. Данные эксперимента представлены в таблице.

Пример 4. Определение бензидина в сыворотке крови.

Растворы реактивов готовят аналогично, согласно инструкции: ТХУ количественно растворяют в 50 мл дистиллированной воды; аммоний сульфаминовокислый в 25 мл; NЭД разводят в 10 раз. К 0,1 мл сыворотки приливают 1,4 мл дистиллированной воды, 0,5 мл ТХУ. Центрифугируют. Центрифугат разливают по 0,5 мл в две пробирки, приливают по 0,1 мл 4 н. соляной кислоты. Одну из пробирок помещают на 45 мин на кипящую водяную баню для гидролиза ацетилированного бензидина. Все пробы ставят на 30 мин в холодильник 4^oC. Диазотируют с 0,1 мл свежеприготовленного раствора нитрита натрия, полученного экстракцией полоски с натрием азотистокислым в 2,0 мл дистиллированной воды по инструкции. Через 4 мин приливают по 0,1 мл аммония сульфаминовокислого и через 2 мин по 0,2 мл раствора NЭД. Пробы тщательно перемешивают при каждом добавлении реактивов. Стандарт бензидина готовят аналогично пробам, используя полоски со стандартной дозой 0,018 мкмоль. Пробы ставят в темное место и через час фотометрируют.

В негидролизованных пробах определяют концентрацию свободного бензидина в сыворотке в ммоль/л. Расчет концентрации осуществляют по формуле:

Оптическая плотность опытных негидролизованных проб в среднем составила 0,375±0,008, стандарта 0,132. Концентрация свободного бензидина в сыворотке при расчете равнялась 0,512±0,010 ммоль/л.

В гидролизованных пробах определяют концентрацию общего бензидина в сыворотке крови. Средняя оптическая плотность гидролизованных проб составила 0,444±0,009, стандарта 0,132. Концентрация общего бензидина в сыворотке при расчете равнялась 0,606±0,012 ммоль/л.

Согласно данным, полученным авторами при испытании предлагаемого набора с различными соединениями, относящимися к первичным ароматическим аминам, отмечается повышение точности метода при хорошей сопоставимости и известным способом (таблица). Кроме того, метод позволяет долго сохранять реактивы и использовать их на 100% по мере надобности. По известному методу реактивы готовятся в больших объемах, в частности нитрит натрия и стандарты первичных ароматических аминов. Уменьшение их объемов ведет к снижению точности навески, хранение этих растворов не рекомендуется, так как ведет к распаду нитрита натрия или выпадению в осадок первичного ароматического амина.

Таким образом, предлагаемый авторами набор позволяет съэкономить 80% затрат на реактивы нитрита натрия и стандартных растворов. Набор предоставляет дефицитные реактивы: аммоний сульфаминовокислый и N-(I)-нафтилэтилендиаминодигидрохлорид, полный подбор реактивов, отсутствие необходимости взвешивания, простота приготовления растворов, надежное их хранение, полную инструкцию при выполнении определения, что экономит 50% рабочего времени опытного специалиста. Экономическая эффективность от предложенного авторами набора на проведение 1000 анализов в год составит приблизительно 0,5 ставки лаборанта.

Использование: в области медицины, в частности при определении химических веществ в растворах и биологических жидкостях. Сущность изобретения: набор для определения первичных ароматических аминов, содержащий пять флаконов в соответствующих упаковках с трихлоруксусной кислотой, натрием азотнокислым, аммонием сульфаминовокислым, N-(I)-нафтилэтилендиаминодигидрохлоридом и стандартом анализируемого амина. Набор позволяет упростить определение и повысить ее точность. 1 табл.

Набор реактивов для определения первичных ароматических аминов в растворах и биологических жидкостях, включающий трихлоруксусную кислоту, натрий азотнокислый, аммоний сульфаминовокислый N-(1)-нафтилэтилендиамино дигидрохлорид и стандарт анализируемого вещества, отличающийся тем, что набор содержит в соответствующих упаковках навеску трихлоруксусной кислоты, которая при растворении в 50 мл дистиллированной воды дает раствор, осаждающий белки, полоски бумаги с натрием азотнокислым, приспособленные для получения раствора для диазотирования непосредственно перед определением (ex tempore), навеску аммония сульфаминовокислого, которая при растворении в 25 мл дистиллированной воды дает раствор для связывания избытка натрия азотистокислого, раствора N-(1)-нафтилэтилендиаминодигидрохлорида для получения окрашенного азосоединения, полоски бумаги, содержащие 0,018 мкмоль стандартного анализируемого амина.