СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЭНЗИМА А В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ Советский патент 1968 года по МПК C12G1/48 

Известен способ количественного определения коэнзима А в биологических объектах путем проведения реакции ацетилирования ариламина в инкубационной среде в присутствии коэнзима А. При этом инкубационная среда содержит, кроме ариламина, ацетат, цитрат, аденозинтрифосфорную кислоту (АТФ), цистеин и ацетилирующую ферментную систему.

После некоторого периода инкубации реакцию ацетилирования прекращают путем воздействия фиксатора. Обычно для остановки ферментативных реакций в качестве фиксирующего агента применяют раствор трихлоруксусной кислоты, который вызывает выпадение фермента.

Белковый осадок удаляют центрифугированием и декантацией. Затем проводят анализ ацетилированного ариламина. Для этого в центрифуге осуществляют реакцию диазотирования, приводящую к образованию окрашенного соединения с неацетилированным амином. Последующее спектрофотометрирование этого соединения позволяет путем расчета определить количество ацетилированного ариламина и пропорционального ему количества коэнзима А.

Предложено в качестве ариламина использовать 4-сульфо-4′-аминоазобензол, а фиксацию реакции ацетилирования проводить 0,1 н. соляной кислотой. При этом стадию спектрофотометрирования осуществлять непосредственно после фиксации в максимуме поглощения ацетилированного ариламина при 364 ммк. Это позволяет упростить и ускорить процесс при повышении точности определения коэнзима А.

Способ состоит в следующем.

В десятимиллилитровые пробирки помещают при 4°С по 1,0 мл пробы, содержащей коэнзим А, 0,2 мл инкубационной смеси и 0,1 мл препарата ацетилазы (2 мг белка). В нулевую пробу помещают 1,0 мл воды, 0,2 мл инкубационной смеси, 0,1 мл препарата ацетилазы. Контрольная проба содержит известное количество коэнзима А. Пробирки закрывают, встряхивают и помещают в термостат при 37°С на 30 мин. Затем в пробирки вносят по 5 мл 0,1 н. HCl и проводят спектрофотометрирование при 364 ммк (можно использовать фотоэлектрокалориметр ФЭК-56).

10 мл инкубационной смеси содержат:

ацетат магния, тетрагидрат 129 мг

цитрат калия трехзамещенный, моногидрат 324 мг

аденозинтрифосфорную кислоту 127 мг

водный раствор СААБ (1,33 мг/мл) 2,5 мл

цистеин 60 мг.

Инкубационная смесь имеет рН 7,5.

Для определения содержания коэнзима А в исследуемом образце расчет ведут по формуле

где ΔE_x - экстинкция контрольной пробы, содержащей m_к мкг коэнзима А против нулевой пробы;

ΔЕ_к - экстинкция исследуемой пробы, содержащей m_x мкг коэнзима А против нулевой пробы.

Способ количественного определения коэнзима А в биологических объектах путем проведения реакции ацетилирования в инкубационной среде, содержащей ацетат, цитрат, аденозинтрифосфорную кислоту, цистеин, коэнзим А, фиксации (прекращения) реакции ацетилирования с последующим анализом ацетилированного ариламина, включающим стадию спектрофотометрирования, отличающийся тем, что, с целью упрощения и ускорения процесса, а также повышения точности определения коэнзима А, в качестве ариламина используют 4-сульфо-4′-аминоазобензол, а фиксацию реакции ацетилирования проводят 0,1 н. соляной кислотой, при этом стадию спектрофотометрирования осуществляют непосредственно после фиксации в максимуме поглощения ацетилированного ариламина при 364 ммк.