СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИМЕРНОГО АДСОРБЕНТА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ СЫВОРОТОЧНОГО АЛЬБУМИНА Советский патент 1998 года по МПК C08F220/56 C08F226/10 G01N33/48 

Изобретение относится к химии полимеров, а именно к способам получения полимерного адсорбента для выделения и очистки сывороточного альбумина. Использование изобретения возможно в препаративной биохимии и медицине для выделения и очистки сывороточного альбумина (СА) из источников животного происхождения, а также для очистки и доочистки продажных препаратов этого белка. СА белок плазмы крови является чрезвычайно важным по выполняемым им функциям (транспортной и другим). Использование этого белка в биохимической и медицинской практике предполагает высокую чистоту препаратов, достигаемую использованием соответствующего метода его очистки.

Известен способ получения полимерного адсорбента для выделения и очистки СА путем обработки геля агарозы бромцианом и последующего ковалентного связывания билирубина с активированной матрицей [1]
Недостатком способа является низкая устойчивость адсорбента. Как полисахаридная матрица агарозы, так и билирубин быстро разрушаются в условиях колоночной хроматографии. Кроме того, выделяемый таким способом СА содержит билирубин и продукты его распада, чрезвычайно прочно связывающиеся с белком.

Известен способ получения полимерного адсорбента для выделения и очистки СА путем обработки геля эпоксиактивированной агарозы (Сефарозы 4-В) раствором двунатриевой соли иминодиуксусной кислоты в 2 М растворе карбоната натрия, последующего нагревания продукта до 65^oC и обработки водными растворами солей двухвалентных переходных металлов [2]
Недостатком способа является низкая устойчивость полимерного адсорбента (агарозного геля) и, как следствие этого, невозможность его многократного использования. Кроме того, выделяемый СА содержит примеси других белков плазмы крови.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемым результатам является способ [3] получения полимерного адсорбента для выделения и очистки сывороточного альбумина путем радикальной тройной сополимеризации гидрофильного винилового мономера (N-винилпирролидона), образующего полимерную матрицу геля, бифункционального мономера-сшивателя (N,N-метиленбисакриламида) и сомономера-лиганда в водном растворе, в присутствии инициатора радикального типа, в котором в качестве сомономера-лиганда используют цетилметакрилат, и сополимеризацию проводят при нагревании при следующем соотношении компонентов реакционной смеси, мас.

Гидрофильный виниловый мономер 10-20
Бифункциональный мономер-сшиватель 0,65-1,0
Сомономер-лиганд 1,5-3,0
Вода остальное до 100
Недостатком способа является невысокая степень очистки СА. Белок, выделенный этим способом, всегда связан с элюатом додецилсульфонатом натрия, который не отделяется от белка.

Целью изобретения является увеличение степени очистки сывороточного альбумина и повышение устойчивости адсорбента.

Поставленная цель достигается тем, что в способе получения полимерного адсорбента для выделения и очистки СА путем радикальной сополимеризации гидрофильного винильного мономера, образующего матрицу геля, бифункционального мономера-сшивателя и сомономера-лиганда в водном растворе в присутствии инициатора радикального типа в качестве сомономера-лиганда используют (мет)акрилоильное производное L лизина общей формулы

сополимеризацию проводят при соотношении компонентов реакционной смеси, мас.

Гидрофильный винильный мономер 4,5-17,5
Бифункциональный мономер-сшиватель 0,5-7,5
Указанный сомономер-лиганд 0,1-2,5
Вода До 100
а полученный сополимер обрабатывают раствором солей меди (II) или цинка (II) концентрации 1 мг/мл до полного его насыщения. При этом в качестве гидрофильного винильного мономера предпочтительно используют акриламид или N-винилпирролидон, а в качестве бифункционального мономера-сшивателя - N, N-метиленбисакриламид или диэфир метакриловой кислоты и этиленгликоля. В качестве гидрофильного винильного мономера могут быть использованы также известные мономеры, такие как акриловая и метакриловая кислоты и другие, в качестве мономеров-сшивателей бифункциональные акриловые и метакриловые мономеры диэфиры акриловой кислоты и этиленгликоля и пр. Инициаторами радикальной полимеризации являются водорастворимые инициаторы (персульфат аммония и другие перекиси). Возможно также применение различных ускорителей и катализаторов, например N,N,N',N' -тетраметилэтилендиамина (ТЭМЕД).

Возможность выделения и очистки СА на полученных адсорбентах определяется тем, что хелатный комплекс иона металла и аминокислоты в составе адсорбента связывается при хроматографировании с белками (а в принципе и с другими соединениями), содержащими свободные сульфгидрильные группы SH, в то время как не содержащий таких групп СА выходит с колонки с адсорбентом хорошо разрешенным пиком.

Из приведенных ниже примеров и данных таблиц следует, что предлагаемый адсорбент для выделения и очистки СА обладает высокой эффективностью и повышенной стабильностью. Этот синтетический полимер способен функционировать в течение длительного времени, не подвергаясь разрушению биологическими средами. Способ получения полимерного адсорбента позволяет изменять конструкционные свойства полимерного материала в широких пределах: в зависимости от концентрации мономера-сшивателя можно получать твердые или мягкие, прочные или легко разрушаемые гели. Кроме того, в случае падения эффективности гелей после неоднократных разделений можно легко регенерировать их, вымывая ион металла этилендиаминтетрауксусной кислотой и вновь насыщая ионами металла.

Пример 1. Реакционную смесь указанного состава дегазируют в течение 15-20 мин и полимеризуют в течение 0,5-1 ч. Полученный гель измельчают на нейлоновых ситах, отмучивают и оставляют набухать в физиологическим растворе до прекращения изменения массы. Набухший гель помещают в колонку требуемого размера и обрабатывают при комнатной температуре водным раствором пятиводного сульфата меди концентрации 1 мг/мл до полного насыщения геля, снова промывают физиологическим раствором до прекращения вымывания ионов меди и уравновешивают на колонке (размером 1,4 х 10 см) фосфатным буфером с pH 7,4. На колонку наносят 5 мл свежей цитратной плазмы крови или 5 мл раствора товарного СА в фосфатном буфере (концентрация 0,5 мг/мл). Элюирование проводят дистиллированной водой до исчезновения поглощения при 280 нм в элюате. Элюат лиофильно высушивают и проверяют белок на гомогенность по электрофорезу. Анализ N- и C-концевых аминокислот проводят по стандартным методикам. В качестве N-концевой кислоты найден аланин, C-концевой аспарагиновая кислота. Степень очистки белка составляет 7. Данные по примерам 2-20 и по свойствам адсорбентов приведены в табл. 1 и 2.

Таким образом, изобретение позволяет получать адсорбент для выделения и очистки СА с высокой степенью очистки, обладающий повышенной стабильностью и имеющий существенные преимущества по сравнению с известными адсорбентами.

1. Способ получения полимерного адсорбента для выделения и очистки сывороточного альбумина путем радикальной тройной сополимеразации гидрофильного винильного мономера, образующего матрицу геля, бифункционального мономера-сшивателя и сомономера-лиганда в водном растворе в присутствии инициатора радикального типа, отличающийся тем, что, с целью увеличения степени очистки сывороточного эльбумина и повышения устойчивости адсорбента, в качестве сомономера-лиганда используют (мет)акрилоильное производное L-лизина общей формулы

где R - H, CH₃,
сополимеризацию проводят при следующем соотношении компонентов реакционной смеси, мас.%:
Гидрофильный винильный мономер - 4,5 - 17,5
Бифункциональный мономер-сшиватель - 0,5 - 7,5
Указанный сомономер-лиганд - 0,1 - 2,5
Вода - До 100
а полученный сополимер обрабатывают растворами солей меди (II) или цинка (II) концентрации 1 мг/мл до полного его насыщения.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве гидрофильного винильного мономера используют акриламид или N-винилпирролидон.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве бифункционального мономера-сшивателя используют N,N-метиленбисакриламид или диэфир метакриловой кислоты и этиленгликоля.

1. Способ получения полимерного адсорбента для выделения и очистки сывороточного альбумина путем радикальной тройной сополимеразации гидрофильного винильного мономера, образующего матрицу геля, бифункционального мономера-сшивателя и сомономера-лиганда в водном растворе в присутствии инициатора радикального типа, отличающийся тем, что, с целью увеличения степени очистки сывороточного эльбумина и повышения устойчивости адсорбента, в качестве сомономера-лиганда используют (мет)акрилоильное производное L-лизина общей формулы

где R H, CH₃,
сополимеризацию проводят при следующем соотношении компонентов реакционной смеси, мас.

Гидрофильный винильный мономер 4,5 17,5
Бифункциональный мономер-сшиватель 0,5 7,5
Указанный сомономер-лиганд 0,1 2,5
Вода До 100
а полученный сополимер обрабатывают растворами солей меди (II) или цинка (II) концентрации 1 мг/мл до полного его насыщения.