Способ получения иммобилизованной кислой протеиназы Советский патент 1983 года по МПК C12N9/62 C12N11/08 

Изобретение относится к ферментной промышленности, в частности к способу получения препаратов иммобилизованной на синтетических полимерах кислой протеинаэы, которая широк применяется в пищевой промьшшенности и медицине. Изобретение может быть использовано для получения высокоактивных стабильных препаратов иммобилизованных кислых протеинад. Кислая протеиназа (КП) продуцируется микроскопическими грибами вида Aspergillus при их поверхностной культивации. Существует несколько ви дов этого гриба, способных продуциро вать различные типы протеиназ. Наибольший интерес с точки зрения гидро лиза высокомолекулярных белков представляет КП, вьщеляемая из Aspergil- lus foetidus Препарат, получаемый на основе этого продуцента, называемый пектофоетидином П10Х, содержиу смесь ферментов, в том числе и КП. Эта протеиназа стабильна в области рН 2,5-6,0 и успешно применяется для препаративного гидролиза высокомолекулярных белков, присутствукнцих в не которых кислых пищевых напитках и от рицательно сказывающихся на их ка-/ честве. КП из пектофоетидина П10Х имеет молекулярную массу около 40000, инги бируется N-2,4-динитрофенил-Ы-диазоацетилэтилендиамином и пепстатином, а ее активность при 20°С (рН 2,5-6,0 сохраняется лишь в течение 24 ч, пос ле чего указанная КП полностью инактивируется. Использование КП для .гидролиза вы сокомолекулярных белков в силу указанных свойств связано с рядом трудностей, обусловленных низкой стабиль ностью препаратов, приводящей к существенной потере активности КП при проведении гидролиза белков в течение 2-3Ч. Эти трудности могут быть преодолены использованием препаратов иммобилизованного фермента. ; Известен получения иммобилизованной кислой протеиназы путем ковалентного связывания фермента с водонерастворимым носителем, заключающийся в том, что модифицированное «А-аминопропилтриэтоксисиланом неорга ническое стекло, выступающее в роли водонерастворимого носителя, обрабатывают глутаровым альдегидом, а затем раствором фермента 1. Недостатком способа являются низкая ферментативная активность препаратов иммобилизованного фермента (она составляет 23-24% от исходной), а также низкая устойчивость препаратов при хранении за счет гидролиза азометичовых связей, посредством.которых проводится ковалентное связыва ние фермента с носителем. Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к предлагаемому является способ получения иммобилизованной кислой протеиназы путем связывания фермента с водонерастворимым носителем, который за1ключается в обработке нерастворимого стёкла -аминопропилтриэтоксисиланом (введение на поверхность стекла первичных реакционноспособных аминогрупп) в ацетоне, последующей обработке модифицированного носителя янтарным ангидридом в диметилформамиде (введение карбоксильных групп) и последующем активировании карбоксильных групп носителя водорастворимыми карбодиимидами и обработке активированного носителя раствором фермента при 4°С в течение 12 ч 2. Недостатком способа является низкая ферментативная активность иммобилизованного фермента, . составляющая 23-51% от исходной. Цель изобретения - повышение ферментативной активности. Поставленная цель достигается тем, что в способе получения иммобилизованной кислой протеиназы, заключающемся в связывании фермента с носителем, ферментосодержащий раствор предварительно подвергают ацилированию хлоранпщридом акриловой или метакриловой кислоты при рН 2,5-i,5 и мольном соотношении фермент: хлорангидрид - 1: (100-400) и связьшание фермента с носителем осуществляют совместной полимеризацией ацилированного фермента с гидрофильным ненасыщенным мономером в присутствии бифункционального сшивателя. Обычно в качестве ферментсодержащего раствора используют раствор пектофоетидина ПЮХ или его ультраконцентрат. В качестве гидрофильного мономера обычно используют акриламид или иетакриламид или N-винилпироллидон, в качестве сшивакхцего агента N,N-мeтиленбисакриламид -или диэфир метакриловой кислоты и этиленгликоля со степенью полимеризации 3 или 13. При этом полимеризацию обычно проводят при концентрации гидрофильного мономера в реакционной смеси 2,520 вес. %, а бифункционального, сшивакяцего агента 0,1-17 вёс.%. Способ позволяет получать иммобилизованный ферментный препарат на основе кислой протеиназы с активностью 93-99%. Предлагаемый способ осуществляют следующим образом. Соответствующее количество пектофоетидина П10Х, имеющего определенную активность, которая выражается в единицах активности, растворяют в 100 вес.ч. воды, добавляют необходимое количество хлорангидрида, перемешивают в течение 15-20 мин., затем в эту же смесь вносят гидрофильный мономер, бифункциональный мономерсшиватель, инициатор радикальной полимеризации (персульфат аммония) и продувают аргоном в течение 2030 мин. После этого добавляют катали затор полимеризации (N, N, N N-тетраметилэтилендиамин) и полимеризуют i ч. После окончания полимеризации получившийся гель измельчают на,нейлоновых ситах, промывают водой и вод носпиртовой смесью и оставляют набухать в буфере, в котором предполагается проведение определения ферментативной активности.Общее время полу чения гели 4-5 ч. : Образующиеся продукты представляют собой сильно набухающие в воде гидрогели и используются для гидроли за белков либо путем инкубирования соответствующей навески геля с раствором белка, либо путем хроматографи рования раствора белка через колонку, заполненную нерастворимым прлимером с иммобилизованной КП. Поскольку исходное вещество представляет собой неочищенный продукт, то количество КП в нем крайне трудно установить. Препараты подобного типа характеризуют относительной активнос тью, выражаемой в единицах протеолитической активности. При этом за еди ницу протеолитической активности при нимают такое количество фермента в мг, которое вызывает прирост оптичес кой плотности при 280 Нм на одну еди ницу (при определении активности соответствующим образом) за 1 мин. Поскольку истинное количество КП в пек тофоетидине П10Х неизвестно, то активность ее определяется по единицам активности. Так 1 г пектофоетидина П10Х имеет активность 40 единиц. Про теолитическая активность при этом оп ределяется по 2%-ому раствору гемоглобина в 0,05 М ацетатном буфере (рН 4,5) при , Степень связывани фермента определяют по отношению активности получаемого препарата, промытого, до полного вымьшания несвязан ного белка, к активности исходного, выраженную в %. Ацилирование хлорангидридами пектофоетидина nipx в pacoJBOpe, также какацилирование его ультраконцентра та, проводят при рН 2,5-4,5. Более высокие значения рН приводят К инактивации фермента. В качестве гидрофильных мономеров используются широкораспространеннйе мономеры - акриламид, метакриламид, винилпироллидон и пр. Сшивателями являются типичные бифункциональные мономеры: акрилаты и метакрилаты зтиленгликоля или его тепломеров и полимеров (эфиры ТГМ-3, ТГМ-13 и пр.), Ы,Ы-метиленбисакриламид и пр. Инициаторами радикальной полимеризации служат персульфаты щелочных металлов с тетраметилэтилендиамином, рибофлавин, которые растворимы в воде и работают при комнатной температуре. Инициатором может служить УФ-облучение. Пример. 20 г пектофоетидина ПЮХ растворяют в 100 мл воды, охлаждают до и доводят до рН 2,5. этому раствору по каплям добавляют 2 г хлорангидрида акриловой кислоты и раствор перемешивают в течение 1520 мин, доводят до комнатной температуры за этот промежуток времени, и в этот же раствор добавляют при перемешивании 5 г акриламида и 0,2 г метиленбисакриламида. В раствор вносят 0,003 г персульфата аммония, продувают аргоном в течение 20-30 мин, добавляют 0,003 г тетраметилэтилендиамина и оставляют на 1 ч. Образовавшийся гель измельчают на нейлоновых ситах, промывают водой и 5%-ным водным этанолом из расчета 0,5 л раствора на 1 г геля. Протеолитическую активность определяют по 2%-ому раствору гемоглобина в качестве субстрата. Гемоглобин растворен в 0.05 М ацетатном буфере (рН 4,5) при 37 С. Активность через неделю и через месяц определяют ан алогичным образом, храня препараты при 4с. Примере. Все операции выполняют так же, используя вместо раствора , пектофоетидина (10 г на 100 мл воды) ультраконцентрат пектофоетидинаПЮХ в количестве 100 мл. Содержание активного начала в препарате также равно активности 10 г пектофоетидн на ПЮХ. Данные по примерам 1-7 приведены в табл.

7Д014882 °

Таким образом, пpвдлaгae tый спо-зации позволяет одновременно иммоби-.

соб позволяет получать аысокоактив-лизовать КП из сырца и сформировать

ныв препараты иммобилизованной кис-матрицу водонерастворимого носителя,

лов протеиназы. Получающиеся иммоби-для чего не требуется очищать ферлиэованные препараты стабильны в те- мент по известным биохимическим спочениё длительного времени (стабиль- собам.

ность самой КП всего 24 ч), не требу- Способ можно использовать для

ет специальной очистки фермента, по-очистки различных кислых пищевых растскольку предлагаемый способ иммобили-ВОРОВ от высокомолекулярных белков.

1, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИШ1ОБИЛИЗОВАННОЙ КИСЛОЙ ПРОТЕИНАЗЫ путем связывания фермента с носителем, о тли ч.аю щ и йс я тем, что, с целью повышения активности получаемого продукта, ферментсодержгиций раствор предварительно подвергают ацилированига хлорангидрндом акриловой или метакриловой кислоты при рН 2,5-4,5 и мольном соотношении фермент: ллорангидрид-ls