Способ получения полимерного гидрогеля с ковалентно иммобилизованным ферментом-холинэстеразой Советский патент 1991 года по МПК C08F289/00 C08F2/16 C12N11/08 

где У. 50-55 мол. 7, у 10-15 мол.%, z 40-40 мо-т Л, мол. м. 50000-100000.

2 табл.

Изобретение относится к химии полимеров и химической энэимологии, а именно, к способу получения иммобилизованной на синтетических полимерах холинэстеразы.

Цель изобретения - повышение устойО

чивости иммобилизованного фермента к действию фосфорорганических соединений при сохранении общей ферментатив- ной активности.

Пример 1. Смесь мономеров, состоящую из 63,1 г (0,6 М) 4-винил- пиридина (4-ВП) и 7,1 г (0,1 М) акрил- „ амида (АА) растворяют в 120 мл диме- тилформамида, добавляют 0,12 г ди- нитрила азобисизомасляной кислоты, обезгаживают и полимеризуют при 60°С 24 ч. Синтезированный сополимер осаждают избытком диэтилового эфира, сушат, растворяют в 100 мл метанола и проводят реакцию с 2,8 г (0,014 М) фенацилбромида при 60°С 6 ч. Образующийся продукт выделяют осаждением в диэтиповом эфире и после сушки раст- воряют в 40 мл абсолютного этанола, прибавляют 1,1 г солянокислого гидро- ксиламина (0,016 М), 40 мл пиридина и выдерживают реакционную смесь при 80°С 5 ч. Сополимер осаждают диэтило вым эфиром и высушивают. Содержание звеньев АА и 4-ВП в сополимере определяют по данным элементного анализа некватернизованного образца, количество звеньев 4-винил-Ы-фенацилок- симпиридинийбромида (4-ВФП) рассчитывали по данным ИК-спектроскопии и потенциометрического титрования окси- мированного образца и модельных систем. Для данного сополимера значения параметров х,у и z составляют 52,13 и 35 мол.% молекулярная масса, определенная методом светорассеяния, составляет 85000.

В табл.1 приведены данные синтеза, сополимеров 4-винил-фенацилоксимпири- динийбромида, 4-винилпиридина и акрил амида.

Примерб. 2 г ацетилхолинэс

теразы растворяют в 100 мл 0,1 М

фосфатного буфера (рН 8,5), охлаждают до и по каплям добавляют 21 мг хлорангидрида метакриловой кислоты, после чего раствор перемешивают 15- 20 мин. К этому же раствору добавляют при перемешивании 29,4 г АА; 13,2 г N N-метиленбисакриламида; 2,2 г сополимера, полученного по примеру ; 0,008 г персупьсЬата аммония, продува

о Q

5

0

ют аргоном 20-30 мин, затем добавляют 0,008 г Н,Ы,И-тетраметилэтиленди- амина и оставляют на 1 ч. Образовавшийся гель измельчают на нейлоновых ситах, промывают деионизованной водой ч водно-спиртовой смесью и оставляют набухать в воде. Активность иммобилизованной холинэстеразы определяют спектро&отометрически nood -на Ьтилаце- тату. В качестве ингибитора холинэстеразы используют ДДВФ. Время полуинак- тиваиии исходной ацетилхолинэстеразы - 19 мин, иммобилизованной - 39 мин.

В табл.2 приведены свойства полимерного гидрогеля с ковалентно иммобилизованной холинэстеразой.

Пример 13 (контрольный).Все операции проводят аналогично примеру 6, используя те же соотношения реагентов, но вместо сополимера, полученного по примеру 1, используют сополимер, полученный по примеру 4. Время полуинактивдции иммобилизованной холинэстеразы ДДВФ - 19,5 мин, исходной - 19 мин, остаточная активность - 97% от исходной.

Приме р 14 (контрольный). Все операции проводят аналогично примеру 7, берут те же количества исходных веществ, но при этом используют сополимер, полученный по примеру 5. Время полуинактивации иммобилизованной холинэстеразы фосфаколом 16 мин, исходной - 16 мин, остаточная активность - 98% от исходной.

Пример 15 (контрольный). Все операции проводят аналогично примеру 6, используя те же соотношения реагентов, но при этом берут 0,7 г (0,5 мас.%) сополимера, полученного по примеру 1. Период полуинактивации иммобилизованной холинэстеразы ДДВФ - 19,3 мин, исходной - 19 мин, остаточная активность - 98% от исходной.

Пример 16 (контрольный).Все операции проводят аналогично примеру 7, используя те же соотношения реагентов, но при этом берут 5,9 г (5 мас.%) сополимера, полученного по примеру 2. Время полуинактивации иммобилизованной холинэстеразы фосфаколом- 16,1 мин, исходной - 16 мин. Остаточная активность - 67% от исходной.

Приме р 17 (сравнительный). Все операции проводят аналогично примеру 6, используя те же соотношения .. реагентов, но при этом в реакционную смегь не добавляют сополимер указанной структуры. Время полуинактивации иммобилизованной холинэстеразы - 19,2 мин, исходной - 19 мин.

Таким образом, предлагаемый спосо позволяет получать препараты иммобилизованной холинэстеразы, обладающие повышенной устойчивостью иммобилизованного фермента к действию фосфор- органических соединений (в 2,0-3,3 раза), при сохранении ферментативной активности.

Формула изобретения Способ получения полимерного гидрогеля с ковалентно иммобилизованным ферментом - холинэстераэой путем ацили рования водного раствора фермента

хлорангидридом ненасыщенной кислоты при рН 7,5-9,00 и молярном соотношении фермент:хлорангидрид, равном 1:10-200, и последующей радикальной сополимеризации ацилированного фермента с гидрофильным мономером и бифункциональным сомономером-сшивате- лем, отличающийся тем,

0 что, с целью повышения устойчивости иммобилизованного фермента к действию фосфорорганических соединений при сохранении общей ферментативной активности, сополимеризацию ацилирован5 ного фермента проводят в присутствии 1-4% от массы реакционной смеси линейного водорастворимого сополимера общей формулы

Изобретение относится к -iCH2-CH)r CH2-CHV CH2-CH 2 химий полимеров и химической энзимо- 1 логии и может быть использовано в химическом анализе и медицине для определения субстратов холинэстеразы, детоксикации биологических жидкостей и медицинской диагностики. Изобретение позволяет создать полимерный гидрогель с ковалентно иммобилизованной холинэстераэой, обладающей повышенной (в 2,0-3,3 раза) устойчивостью к действию фосфорорганических соединений при сохранении общей ферментативной активности. Это достигается ацилирова- ннем водного раствора холинэстеразы хлорангидридом ненасыщенной кислоты при рН 7,5, 9,0 и молярном соотношении фермента и хлорангидрида 1:(10- и последующей радикальной сопо- лимеризацией ацилированного фермента с гидрофильным мономером и бифункциональным сомономером - сшивателем в присутствии 1-4% от массы реакционной смеси линейного водорастворимого сополимера общей формулы V CH2-CH NHo Ј (Л о СО -и 0 J ю

- снгсн)х-{сн2-сн)у- сн2-сн)г

где х У

50-55 мол.%; 10-15 мол.%;

4(контрольный)

5(контрольный)

Сополимер 4-винилпиридина м акриламида до обработки ФАБ. Примечание. Динитрил азобисизомаслякой кислоты используется в следующих

количествах: пример 2 - 0,2 г; 3 - 0,06 г; 4 - 0,04 г; 5 -0,25г Сокращения: 4-ВП - 4-вкннлинридин; АА - акриламид; ФАБ - фенацилвромнл; ; ГАМ - ГИДрОКСИЛвМИЯ СОЛЯНОКИСЛЫЙ.

:NFU

СН9Вг

I L

)Н

z 30-40 мол.%, с мол.м. 50000-100000.

Таблица

Примечание.

С/А - период полуинактивации; Т - температура; ХЭ -холинэстераэа; АХЭ -ацетнлхолинэстераза; БуХЭ - бутя- рилхОлннэстераэа; ДДВФ - 0,0-диметил-0-дихлор8инилфосфат; ФК - фосфакол; АХ - хлорангидрид акриловой кислоты; ИХ - метакриловой; АА - акриламид; ВПЛ - Н-вннилпироллидон; МА - метакриламид; БИС - Н Ы-хвтиявя- бисакриламид; ТГМ-3 - диэфир метакриловой кислоты и этиленгяиколя со степенью полимериз иин з; тгм-исо степенью полимеризации 13.