Способ определения активности протеаз Советский патент 1984 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к биохими и медицинской диагностике и предназначено длк измерения следовых количеств пссус аз, выделяемых из плазмы крови, а также из органов и Тканей при медико-диагностическом и биохимическом исследовании.

. Известен способ определения активности протеаз, включающий гидролиз белка казеината натрия препаратом фермента, который помещается в исследуемый .раствор, с. последуницей инактивацией фермента и осаждением непрогидролизованного белка трихлоруксусной кислотой, В полученном фильтрате определяют количество прогидролизированного белка по содержанию образовавшегося тирозина колориметрическим методом с применением реактива Фолина. Протеолитическая активность препарата выражается в микромолях тирозина, образующегося в гидролизате в. единицу времени l.

Однако этот метод трудоемок, многостадиен, обладает малой чувствительностью и неприменим для окрашенных, сильно поглощающих сред.

Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигае мому эффекту пвляется способ определения активности протеаз, включащий инкубирование люциферазы совместно с протеазой с последующим измерением уменьшения люциферазной активности инкубируемого образца и расчетом протеазной активности по константе инактивации люцифера|зы 2.

Недостатком данного способа является низкая чувствительность (20 кг протеазы на образец ).

Цель изобретения - повышение чувствительности способа.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения активности протеаз, включающему инкубирование люциферазы совместно с протеазой с последующим измерением уменьшения люциферазной ак-. тибности образца и расчетом протеа ной активности по константе инактивации люциферазы, инкубирование люциферазы с протеазой осуществляют при температуре i7-2I°C в течение 9-13 ч.

На фиг. 1 изображена зависимост предельной чувствительности метода от температуры, где по оси ординат отложены значения -натурального логарифма концентрации протеазы (три,син, нг/мл , по оси абсцисс - температура/ на фиг. 2 - кривые изменения биолюминесцентной активности люциферазы в присутствии и отсутствйи прЬтеазы (трипсин J, где по оси ординат показаны значения натурального логарифма интенсивности свечения в относительных единицах, по оси абсцисс - время в часах; на фиг. 3 - лси пературная зависимость минимального времени инкубирования препарата люциферазы с протеазой (трипсин, 5 нг/мп /.

Для определения активности протезы сливают вместе исследуемый раствор протеазы и препарат люциферазы. Полученный образец помещают в термостат и отмечают время начала инкубации. В ходе инкубации через определенные промежутки времени прс изводят измерения биолюминесцентной активности образца, для чего из последнего отбирают аликво ы по 5 мкл.

Полученные данные представляют в виде графика, откладывая по оси .абсцисс время в минутах, а по оси ординат натуральный логарифм интенсивности свечения. График представляет собойпрямую линию, тангенс угла наклона которой к оси абсцисс соответствует константе инактивации люциферазы. Константа инактивации люциферазы связана с.концентрацией протеазы в образце прямой пропорциональной зависимостью.

Для учета неспецифической инактивации люциферазы измерения, аналогичные описанным, проводят в отсутствии протеазы.

За предельную чувствительность метода принимают концентрацию протеазы, дающую,константу инактиваций люциферазы., превышающую на 50% константу неспецифической инактивации. Измеряют предельную чувствительность способа при разных температурах (фиг. 1/. Максимальная чувствительность наблюдается в интервале от 17 до .

Минимальное время совместного инкубирования люциферазы с протеазой при данной температуре определяется следующей формулой:

Ih -

0

t :Чр- i

активность люциферазы

Зл в начале инкубирования; активность 1юциферазы

3 через время t после начала инкубирования;

Кур константа инактивации люциферазы при данной температуре в присутствии протеазы,

Ki - константа инактивации люциферазы при данной температуре в отсутствии протеазы,.

Принимая во внимание, что ошибв измерении активности люциферасоставляет ±5%, очевидно, что товерно отличающиеся значения учаются только в том случае, если разница между этими величинами будет не менее 20%, т.е. 3/3 0,8. Следовательно., формулу для опреде ления минимального времени совместного инкубирования можно переписать в следующем виде: t - - 0. - 0. Учитывая значение констант инак тивации для температурного диапазона 17-21°С, минимальное необходимое время совместного инкубирования составляет 9-13 ч. Концентрация препарата люциферазы 50 мкг/мл. Уменьшать концентрацию препарата люциферазы не сле дует, так как это приводит к умень шению светового сигнала ниже уровн чувствительности прибора.Увеличивать концентрацию препарата выше 100 мкг/мл также нецелесообразно, так как при этом йе происходит увеличения чувствительности метода э расход препарата увеличивается. П.ример. В качестве протеазы используют сухой препарат тр сина из поджелудочной железы быка с удельной активностью 40 ед. на 1 мг препарата (Se-rva ФРГ) и час тично очищенный препарат люциферазы- из Photobacterium phosphoreum. 25 мкл раствора трипсина (10 нг/мл (сливают с 25 мкл препарата люциферазы (50 мкг/мл ) и помещают в термостат при 20°С, отмечая время начала инкубации. Через каждые 2 ч проводят измерения биол минесцентной активности инкубируем го образца, для чего из последнего отбирают аликвоты по 5 мкл. Для измерения биолюминесцентной активности используют следующую реакционную смесь: 50 мкл 0,0025%го раствора миристинового альдегид в дистиллированной воде; 5 мкл инкубацирнной смеси; 445 мкл 0,1 М фосфатного буфра, рН 7,0. В полученной смеси свечение ини циируют &1стрым добавлением 300 мк 5 ФМН-Н2. Для учета неспецифической инактивации люциферазы аналогичные измерения проводят в отсутств.ии препарата трипсина. Кинетика уменьшениябиолюминес центной активности образца в присутствйи и отсутствии трипсина при ведена на фиг. 2. Константы инактивации люциферазы в присутствии и отсутствии трип сина составляют 4 ,.4-10 О ,5 . соответственно. При эти константы составляют 3,0 10 мин-и .0,4 Ю- мин-,при 21 °С - 4,4Б-1(Гмин- и 1,5 Константы достоверно отличаются, поэтому можно сделать вывод, что чувствительность метода позволяет обнаруживать трипсин при концентрации 5 нг/мл или с учетом объема образца (0,05 МП) - 0,25 нг трипсина на iipoay. При мер 2. 25 мкл раствора три-псина (10 нг/мл I сливают с 25 мкл препарата люциферазы (50 мкг/мл) и помещают в термостат, отрегулированный на температуру 17°С, отмечая время начала инкубации. Через каждые 2,5 ч проводят измерения биолюминесцентной активности инкубируемого образца в течение 13 ч, для чего из последнего отбирают аликвоты по 5 мкл. Для измерения биолюминесцентной активности используют следующую .реак-.. ционную смесь. 50 мкл 0,0025%-ного раствора миристинового альдегида в дистиллированной воде; 5 мкл инкубационной смеси, 445 мкл 0,1 М фосфатного буфера, рН 7,0. В полученной реакционной смеси свечение инициируют быстрым добавлением 300 мкл ФМН-Н2. Для учета неспецифической инактивации люциферазы аналогичные измерения проводят в отсутствии препарата трипсина.. Константы инак.тивации в присутст-вии и отсутствии трипсина составляют 3,0 10- мин-и 0,4- 10 мин- соответственно. П р и М е р 3. Полученную инкубационную смесь помещают в термостат при 20°С и отмечают время начала инкубации. Через каждые 2 ч проводят измерения биолюминесцентной активности инкубируемого образца в теченив 10 ч. Для учета неспецифической инактивации люциферазы аналогичные измерения проводят в отсутствии препарата трипсина. Константы инактивации, в присутстВИИ и отсутствии трипсина составляют 4 ,4-10 мини О , соответственно. Чувствительность, метода 0,25 нг трипсина на пробу. П .р и М е р 4. Полученную инкубационную смесь помещают в термостат при 21°С и отмечают время начала инкубации. Через каждые 1,5 ч проводят замер биолюминесцентной активности инкубируемого образца в течение 11 ч. Для учета неспецифической инактивации люциферазы ангшогичные изме зения проводят в отсутствии препарата трипсина. . Константы инактивации в присутствии и отсутствии трипсина составляют 4,45 и 1,5-10- миН-. Чувствительность метода 0,25 нг трипсина на пробу. Таким образом, предлагаемый спрсоб позволяет повысить чувствительность определения активности протеаз на два порядка за счет изменения успо-о ВИЙ инкубации прртеазы с люциферазой.

k

г

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОС ТИ ПРОТЕАЗ, включаюиий инкубирование люциферазы совместно с протеа- ЗОЙ с последующим измерением умень- ; шения люциферазной активности образца и расчетом протеазной активности по константе инактивации люциферазы, отличаюшийс я тем, что, с целью повышения чувствительности способа, инкубирование люциферазы с протеазой осуществляют при температуре 17-21°С в течение 7-13 ч. 05 -чЛ 4

5Iff

15 r

Фиг.2

t,nac 20

15

W

IS

2S