Способ определения активности ингибиторов протеаз Советский патент 1985 года по МПК G01N33/48 

О)

о

00 1.1 Изобретение относится к биохимии и может быть использовано в технической микробиологии и медицинской диагностике. Целью изобретения является сокращение времени определения. Пример. Использовали в качестве ингибитора протеазы контрикал (производ ство ГДР) и гордок (производство Венгрии). В качестве протеазы использовали трип(йЩ:|8егУэ, ФРГ) с удельной активноетью 40 ед на 1 мг препарата и в качестве г люциферазы - частично очищенный препарат .из Photobacterium leiognothi. К 100 мкл растеора трипсина {JOO мгк/мл ; добавляют 20 мкл раствора контрикала (100 АЕ/мл) или 20 мкл раствора гордокса (100 КИЕ/МЛ) и инкубируют в течение 2 ми при , а затем берут аликвоту объемом 120 мкл и добавляют в реакшганную смесь, содержащую 20 мкл ферментного препарата (0,3 мг/мл людаферазы и НАДН:ФМН-оксиЙоредуктазы), 50 мкл 0,005%- ного раствора миристинового альдегида, 50 мкл 6,6-10 М ФМН, 360 мкл 0,1 фосфатного буферарН 7,0 и 300 мкл 2,68-10 М НАДЬ Благодаря избытку протеазы в инкубационной смеси наблюдается падение свечения, обусловленное инактивацией люциферазы под действием остаточной активности протеазы. Сигнал из кюветы прибора, для измерения свечения подают на ФЭУ, а с последнего - на самопищущий потешдиометр с известной скоростью протяжки масщтабной ленты. Остаточную протеазную активность определяют по константе инактивации люциферазы, которая вычисляется по формуле

Ингибитор протеазы Раствор гордокса ({00 КИЕ/мл), О . Ш мкл на пробу К люциферазы, мин 2,4 },96 Раствор контрикала (100 АЕ/ми)

Концентрация ингибитора протеазы. н-н где / и /2 биолюминесценции в момен t соответственно. ты времени t и Измерение падения биолюминесценции проводят в течение 1 мин. Активность ингибитора протеазы определяется разностью между константами инактивации люциферазы в присутствии и отсутствии ингибитора протеазы. Константа инактивации люциферазы обратно пропорциональна количеству добавленного ингибитора протеазы (таблица). Измерение биолюминесценции проводят в термостатируемой кювете при 30° С в течение I мин. В контроле к 100 мкл раствор трипсина добавляют 20 мкл 0,1 М фосфатного буфера. Константа инактивации в контроле равна .2,4 мин, в опыте с контрикалом 1,60 мин и в опыте с гордоксом 1,66 мин. Расчет: в инкубационной смеси находилось 10 мкг трипсина. На определение взято 20 мкл (0,02 мл) раствора гордокса 100 КИЕ/мл (1:50). Разность в контроле и опыте равна 0,74 (2,4-1,66), что соответствует инактивации около 3 мкг трипсина. Следовательно, Г мл гордокса связывает 002 7500 (мкг) трипсина. Таким образом, в предлагаемом способе активность ингибитора протеазы выражается в мг протеазы, связываемых (инактивируемых) 1 мл исследуемого препарат; антипротеазы. Предлагаемый способ сокращает время определения доЗ мин, т. е. более, чем в 20 раз в сравнении с известным способом. 20405065 1,660,950,52О

СПОСОБ ОПРЩЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ИНГИБИТОРОВ ПРОТЕАЗ путем определения разности активности протеазы при инкубации в присутствии и отсутствии ингибитора, отлияа ющийся тем, что, с целью сокращения времени определения, инкубацию проводят в течение 1-2 мин при 27-33° С, а об активности ингабитора протеазы судят по разности скорости падения свечения при добавлении инкубациоиной смеси в раствор, содержащий люшферазу, НАДН:ФМН-ок(Я1доредуктазу и субстраты этих ферментов.