Способ определения активности протеаз Советский патент 1983 года по МПК G01N33/48 

ю

-VJ

CD Изобретение относится к биохимии и может быть использовано в тех 1ической микробиологии и медицинской диагностике. Известен способ определения активности протеаз путем гидролиза белка казеината натрия препаратом Фермента который помещают в исследуе мый раствор с последующей инактивацией фермента и осаждением непрогидролизован ного белка трихлоруксусной кислотой, В полученном фильтрате определяют количество прогидролизованного белка по содержанию образовавщетося тирозина колориметрическим методом с при менением реактива Фолина l . Однако известный способ трудоемок многостадиен, занимает много времени Наиболее близким к предлагаемому является способ определения активнос ти протеаз путем совместного инкубирования люциферазы с исследуемой пробой с последующим измерением биолю линесценции инкубационной среды 2 Недостатком способа является отсутствие иепрерьшиости процесса опре деления протеолитической активности, для измерения необходим многократный отбор небольших по объему проб, что неизбежно приводив к большим ошибкам в определении активности протеаз. Кроме того, для определения протеоли тической активности по известному способу необходима дополнительная графическ-ая обработка. получаемы: дан ных, что вносит дополнительную ошибк |.в определении величины протеолитичес кой активности и не позволяет автома тизировать этот процесс. Цель изобретения ускорение и повышение точности способа. Поставленная цель достигается согласно способу определения активности протеаз путем совместного инку бирования люциферазы g исследуемой пробой с последующим из.мерением биолюминесценции инкубационной среды, при котором в инкубационную смесь предварительно вносят восстановленный никотинамидадениндинуклеотид флавинмононуклеотид оксидоредуктазу и ее субстраты, а исследуемую пробу добавляют после установления стабиль ного уровня свечения. Способ осуществляется следующим образом. Для определения активности протеаз сливают вместе люциферазу, NaDH, РММ-оксидоредуктазу, альдегид, FMN и NaDH, Благодаря избытку NaDH и работе МаОН;FMN oкcидopeдyктaзы создается стационарная концентрация субстрата люциферазы-РМННз, как следствие этого - стабильный уровень свечения. После добавления в полученную смесь протеазы, наблзодается падение люминесценции, обусловленное инактивацией люциферазы под действие ротеазы. Падение люминесценции можо измерять непрерывно, без дополниельного отбора проб, если полученый образец инкубировать непосредстенно в кювете прибора для измерения вечения, детекторной частью котоого является ФЭУ, сигнал с .которого одается на самопишущий потенциометр известной скоростью протяжки масштабной ленты, Протеолитическую активность при этом определяют по константе инактиации люциферазы, которую вычисляют по следующей формуле: где t-t/2 - время, необходимое для уменьшения биолюминесдентной активности на 50%, мин. Для учета неспецифической инактивации люциферазы измерение проводят в отсутствии протеазьь Активность п зотеазы определяют разностью мелоду константами инактивации люциферазы в присутствии и отсутствии протеазы. Пример 1, Используют в качестве протеазы сухой препарат трипсина из поджелудочной железы быка с удельной активностью 40 ед, на 1 мг препарата и частично очищенный препарат люциферазы из Photobacterium phosphoreum, содержащий и NaDH;FMN-оксидоредуктазу. К образцу, содержащему 400 мкл 0,1 буфера, 20 мкл ферментного препарата (0,3 мг/мл людифераза с NaDH:РМЫ-оксидоредуктазой) 50 мкл FMN б, и 50 мкл 0,005%-ного раствора миристинового альдегида, дОбавляют 300 мкл NaDH 2,6SiO М, после достижения стабильного уровня биолюминесценции (10 сек) добавляют 50 мкл раствора трипсина (конечная концеН рация 12,5 мкг/мл) . Измерение биолюминесценции проводят в термостатированной кювете при , Для учета неспецифической инактивации люциферазы проводят экспериментбез добавления трипсина. . Константу инактивации люциферазы рассчитывают по формуле K-in tm Константы инактивации люциферазы в отсутствии и в присутствии трипсина составляют 4, и 2,31 , соответственно. Аналогично подсчитывают константы инактивации для других концентраций трипсина. Предлагаемый способ обеспечивает непрерывность процесса измерения, упрощается процедура в целом и повЫ

31027615

шается точность определения ±5%, что в два раза меньше ошибки, нрсти протеаз, при этом константы .получаемой в известном способе инактивации определяются с точностью (flO%).

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ПРОТЕАЗ путем совместного инкубирования люциферазы с исследуемой пробой с последующим измерением биолюминесценции инкубационной среды, отличающийся тем, что/ с целью, ускорения и повьоиения точности способа, в инкубационную смесь предварительно вносят восстановленный никотинамидадениндинуклеотид флавйнмононуклеотид оксидоредуктаэу и ее субстраты, а исследуемую пробу добавляют после установления стабиль,ного уровня свечения.