Способ получения иммобилизованной монофенол-монооксигеназы Советский патент 1984 года по МПК C12N11/08 

Изобретение относится к получению ико4ОбилизованнЕ2Х ферментов, в частности полифенолмолофенап--моно.оксигеназы (попифенолоксидазы), которая может быть использована как катализато со специфической и контролируемой активностью в химической промышленности и в производстве дубильных веществ, а также в прикладной биохимии и кшкробиологии.

Известен способ иммобилизации про кишленной грибной монофенол-монооксиГЁназы вЖИДКИХ мембранах til

Недостатками способаявляются слолость получения жидких мембран, их нестабильность, а также невозможност многократного использования иммобилизованного эакапсулированного фермент в технологическом цикле из-за малой механической устойчивости эмульсий иммобилизованных ферментов.

Наиболее близким по технической сущности и, достригаемому результату к предлагаемому является способ получения иммобилизованной мойофенолмонойксигенаэы путем обработки органи ческрго носителя (энзакрил АА) раствором, содержащим монофенол-монооксигенаэу. Способ заключается в ковалентНой иммобилизации фермента на органическом носителе (энзакриле АА) с помощью реакции азосочетания С21.

- .

Недостатками изнестнрго способа Являются ннзкая удельная активность целевого продукта (25% от активности растворимого) и длительность иммобилизацйи (65 ч)о

цельИзобретения - сохранение активности фермента при иммобилизации и упрощения процесса.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения иммобилизованной монофенол-монооксигеназы путем обработки органического носителя раствором, содержащим монофенол-монооксигеназу, в качестве носителя используют аминосодержащее полиакрилонитрильное волокно с обменной емкостью 2-3 ммоль/г, а в качестве раствора, содержащего фермент, используют культуральный фильтрат базидиального гриба Coriolus hirsutus.

Предлагаемый способ позволяет использовать полифенолоксидазы, продуцируемые базидиальным грибом Cori- olxis hirsutus, т.е. вести иммобилиза цию из неочищенных культуральных фильтратов, что обеспечивает возможность исключить стсщии осаждения, фильтрации и очистки фермента и таким образом использовать для иммобилизации более дешевый и доступный продукт.

Иммобилизованная на волокнистом носителе полифенолоксилаэа является биологически активным гетерогенным катализатором, что, во-первых, позволяет использовать иммобилизованную полифенолоксидазу, многократно, так как легко осуществить отделение волокна от растворимых продуктов реакции и субстрата, а во-вторых, обеспечивает возможность перевода периодических технологических процессов на непрерывный режим.

Кроме того, -способ иммобилизации отличается простотой и высоким качестве получаемого продукта (выход по активности достигает 85-9в%).

Способ осуществляют следующим образом.

Фермент полифенолоксидазу получают выращиванием базидиального гриба Coriolis hirsutus поверхностным способом на питательной среде, содержащей, г: глюкоза 10, пептон 3, KHjPOi, 0,6, KallPOi. 0,4, MgS04-7HtO 0,5 и СиЗОц 50 мг, ГеЗОг, 7НгО 5 мг И 2 -л водопроводной водыс Продолжительность выращивания гриба составляет 10 сут при 24-26 с. Данный штамм синтезирует внеклеточную полифеноло ксидазу, активность которой составялет 1,48-5,23 ед/мг белкаJ Активность определяют по окислению пиро1 атехина и парафенилендиамина.

Для иммобилизации навеску аминосодержащего полйакрилонитрильного волокна обрабатывают в течение 30-60 мин культуральным фильтратом, полученным в результате выращивания гриба Coriolis birsutus , По оконча:нии обработки продукт промывают дистиллированной водой.

Пример 1. Аминосодержащее полнакрнлонитрильное волокно. (0,5 г) обменной емкостью 2 ммоль/г обрабатывают в течение 30 мин при 18 С 50 МП культурального фильтрата базидиального гриба Coriolis hirsutus с активно9тью 1,48 ед/мг белка Продукт отмывают дистиллированной водой Получают препарат с активностью 4,17 ед/г волокна (90% от исходной).

Пример 2. Аминосодержащее полиакрилонитрильное волокно 0,5 г емкостью 2,5 ммоль/г обрабатывают в течение 45 мин при 20С 50 мл культурального фильтрата базидиального гриба Coriolus hirsutus с активность 4,13 ед/мг белка. Продукт отмывают дистиллированной водой Получают препарат с активностью 25,9 ед/г волокна (85% от исходной).

Пример 3i Аминосодержащее полиакрилонитрильное волокно 0,5 г с емкостью 3 ммоль/г обрабатывают в течение 60 мин при 50 мл культурального фильтрата базидиального гриба Coriolus hirsutus с активность 5,23 ед/мг белка. Продукт отмывают дистиллированной водой. Получают препарат с активностью 40 ед/г волокна (80% от исходной). При иммобилизации фермента происходит образование стабильного комплекса фермент-волокно, что подтверждается устойчивостью связи между носителем и ферментом, которая не разрывается в ацетатном и фосфатном буфере с различной ионной силой и рН. Наиболее вероятно, что связь белка с носителем осуществляется в данном случае по механизму координационно-ионной иммобилизации с образо ванием комплекса металлосодержащий фермент - аминосодержащая хелатообра зующая группировка волокнистого носи теля. Стабильность комплекса фермент волокно оценивается в конкретных технологических процессах, в частнос ти при окислении о-дефенолов. . , Полученные образцы иммобилизованного фермента на аминосодержащем волокне имеют высокую стабильность, позволякидую использовать их многократно, За 7 циклов использования активность снижается только на 30%. Иммо билизованный фермент обладает более высокой термостабильностью, чем рас воримый. Определение активности проводят ,по методу, основанному на измерении активности фермента по скорости обра зования сине-фиолетовой окраски окис ленного диметил-п-фенилендиамина в присутствии пирокатехина. Активность А вычисляют по найденной скорости реакции по формуле 4 - Е(а-а. Ъ) . 7Т где Е - зкстинкция(0,200) J а - отношение количества жидкос ти, взятоЯ для приготовлени вытяжки; 5 - степень дополнительного раз ведения вытяжки; S - степень постоянного разведения вытяжки в реакционной смеси; с - толщина слоя (2 см); t - время (в секундах). При иммобилизации монофспил-монооксигёназы в условиях, параметры которых находятся ниже указанных пределов, не достигается удовлетворительных результатов по активности иммобилизованной на волокне полифенол оксидазы„ Превьииеиие этих условий не обеспечивает роста активности фермента на волокне и является неэкономичным. Использование в качестве носителя аминосодержащего полиакрилонитрильного волокна емкостью менее 2 ммоль/г не обеспечивает полного извлечения фермента из культурапьного фильтрата, а применение волокна емкостью выше 3 ммоль/г -нецелесообразно, поскольку при этом не наблюдается роста активности иммобилизованного фермента. Иммобилизация фермента на волокнистом носителе непосредственно из культурального фильтрата базидиальных грибов экономически нецелесообразна, во-первых, из-за исключения таких стадий выделения и очистки фермента, как осаждение и фильтрация. Во-вторых, стоимость культурального фильтрата невелика по сравнению с чистым ферментом и составляет около 30 руб/т. Иммобилизации непосредственно из культурального фильтрата позволяет снизить расход на получение фермента в 200 раз. Активность иммобилизованной на волокне полифенолоксидазы составляет 80-90% от исходной, что на 55-65% выше по сравнению с известным способом. Эти свойства позволяют рекомендовать ферментсодержащие волокна в качестве биокатализатора, волокнистая форма которого облегчает возможность проведения ферментативных реакций по непрерывной схеме.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ МОНОФЕНОЛ-МОНООКСИГЕНАЗЫ путем обработки органического носителя раствором, содержащим монофенол-монооксигенаэу, отличающийся тем, что, с целью сохранения активности фермента при иммобилизации и упрощения процесса, в качестве носителя используют аминосодержащее полиакрилонитрильное волокно с обменной емкостью 2-3 ммоль/г, а в качестве раствора, содержащего фермент, используют культуральный фильтрат базидиапьного гриба Coriolus hirsutus. (Л