Способ получения целлюлозолитических ферментов Советский патент 1984 года по МПК C12N9/42 

Vl

00 ic

00

tc Изобретение относится к ферментной подотрасли микробиологической промышленности и может быть использовано для получения целлюлаэы методом глубинного культивирования микроскопических грибов на жидких питательных средах. Известен способ получения целлюлозолитических ферментов путем глубинного культивирования продуцента - Trichoderma viride 44, заключающийся в применении в качест ве стимулятора роста и целлюлозолитической активности продуцента целлюлазы экстрактов из биомассы, образованных при термофильном метановом брожении мелассо-зерновой, ацетонобутиловой барды, которые содержат вещества, обладающие способностью ускорять рост и увеличивать накопление мицелия и повышать С и Cj гриба Trichoderma viride Cl. АКТИВНОСТЬ целлюлазы составила 8 ед.мл. Однако в данном способе, не учитывйются оптимапьные концентрации активатора на разных стадиях культивирования; активация роста и раз вития Trichoderma viride 44 осуществляется недостаточно; кроме того низка ферментативная активность. Наиболее близким к изобретению по технической сущности являются среда и способ получения целлюлозолитических ферментов путем глубинного культивирования продуцента Trichoderma viride 44 на среде, со держащей свекловичный жом, однозамещенный фосфат калия, сернокислый магний, сульфат аммония, сульфат х ма и лизаты дрожжей 2. Культивирование ведут в течение 144 ч, активность ферментов . 10,4-11,2 ед/мл. Недостатками известного способа являются низкая активность фермента и большая продолжительность кул тивирования. Целью изобретения является повы шение активности целлюлаз. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получени целлюлозолитических ферментов путем глубинного культивирования про дуцента - Trichoderma viride 44 на питательной среде, содержаще-й свекловичный жом, однозамещенный фосфат калия, сульфат магния, суль фат аммония, сульфат хрома и воду, в культуральную жидкость на экспоненциальной стадии роста дополнительно вводят сульфат хрома в два приема; сначала на 24-32 ч. культивирования в количестве 0,2-0,4 г/л и затем на 72-96 ч .в количестве 0,3-0,5 г/л. Сущность способа заключается в следующем. Готовят питательную среду, соержащую, вес.%: свекловичный жом 1,5-5,0 Дрожжи кормовые 0,3-1,0 Однозамещенный фосфорнойислый калий0,2-0,4 Аммоний сернокислый0,2-0,5 Магний сернокислый 0,02-0,05 Сульфат хрома 0/02-0,04 Вода Остальное Питательную среду.готовят путем последовательной загрузки всех компонентов при постоянном перемешивании, рН среды доводят ортофосфорной кислотой до 4,6,вводят дополнительно. до стерилизации сульфат хрома в количестве 0,2-0,3-0,4 г/л, стерилизуют ocTptjM паром 1 ч при 0,8 ата. Охлажденную до 37°С питательную среду засеивают посевным материалом Trichoderma viride 44 и культивируют глубинным способом при постоянной аэрации культуры воздухом из расчета 1 об/об среды. По истечении 24-32 ч роста культуры в ферментер вьодят вторично сульфат хрома из расчета 0,2-0,3-0,4 г/л в виде сте- . рильного раствора на стадии активного потр.ебления питательных веществ. Третий раз сульфат хрома вводят на стадии активного синтеза целлюлазы на 72-96 ч роста продуцента в количестве 0,3-0,4-0,5 г/л также в виде стерильного раствора. Пример (контроль). В ферментер объемом 50 л при коэффициенте, заполнения 0,5 загружают питательную среду с оптимальными соотношениями компонентов, мае.%: свекловичный жом 1,5.; дрожжи кормовые 0,3;. ( 0,2; 0,2; МдЗО 0,02. Все компоненты питательной среды последовательно загружают в ферментер при перемешивании (180 об/мин), аэрировании воздухом из расчета 1 об/об среды, рН среды доводят ортофосфорной кислотой до 4,6, и всю питательную среду стерилизуют острым паром 1 ч при 0,8 ата. Охлажденную до 37°С питательную среду засевают посевным материалом Trichoderma viride 44. Глубинное культивирование ведут 144 ч. Максимальная ферментативная активность составляет 12 ед./мл (метод Сомоджи-Нельсона). П р и м е р 2. Подготовку питательной среды производят аналогично примеру 1. Состав питательно.й среды вводят дополнительно 0,2 г/л или 5 кг сульфата хрома до стерилизации. Стерилизацию и засев посевным

материалом проводят аналогично при меру 1.

После 24 ч роста культуры вводят еще 0,2. г/л или 5 кг сульфата хрома в виде стерильного раствора. В третий раз сульфат хрома вводят на 72. ч роста, продуцента из расчета 0,3 г/л или 7,5 кг в виде стерильиого раствора. Процесс глубинного культивирования ведут до максимального синтеза фермента, т.е. до 108 ч роста. Ферментативная активность целлюлаэы в этом случае соетавляет 14 ед./ют (метод тот же).

П р и м ё р 3. Подготовку пита,тельной среды производят аналогично примеру 1. в состав питательной среды до стерилизации вводят суль.фат хрома из расчета 0,3 г/л или 7,5 кг. Стерилизацию и засев питательной среды производят аналогично примеру 1. На 28 ч роста культуры Trlchoderma viride 44 вводят вторично 7,5 кг сульфата хрома в виде стерильного раствора, третий раз сульфат хрома вводят на 84 ч рота культуры из. расчета 0,4 г/л или

10 кг в виде стерильного раствора. Глубинное культивирование заканчивают на 108 ч роста культуры. Ферментативная активность целлюлазы в этом случае равна 15 ед./мл (метод тот же).

П р и м е р 4. Подготовку питательной среды производят аналогично примеру 1. В состав питательной среды до стерилизации дополнительно вводят 10 кг сульфата хрома из расчета 0,4 г/л. Стерилизацию и засев питательной среды производя , аналогично примеру 1. На 32 ч роста продуцента вторично вносят 10 кг сульфата хрома из расчета 0,4 г/л в виде стерильного раствора. На 96 ч роста продуцента в третий раз вносят сульфат хрома в количестве 12,5 кг из расчета 0,5 г/л в виде стерильного раствора. Глубинное культивирование продолжают до максимального накопления фермента с активностью 15,5 ед./мл на 108 ч роста продуцента.

Таким образом, реализация изобретения позволяет повысить.активность целлюлаз.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯЦЕЛЛЮЛОЗОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ путем глубинного культивирования продуцента Trichoderma viride 44 на питательной среде, содержащей свекловичный жом, однозамещенный фосфат ка.лия, сульфат магния, сульфат аммония, сульфат хрома и воду, отличающийся тем, что, с целью повышения активности целлюлаз, в культуральную жидкость на экспоненциальной стадии роста дополнительно вводят сульфат хрома в два приема: сначала на 24-32 ч культивирования в количестве 0,20,4 г/л и затем на 72-96 ч в количестве 0,3-0,5 г/л. 8