1
(21)4468135/30-13
(22)27.06.88
(46) 23.12.90. Бюп. № 47
(71)Московский технологический институт пищевой промышленности
(72)В.М.Кантере, М.В.Гернет, Л.П.Замотайлова, Т.В.Калинникова и А.П.Калинников
(53)577.15 (088.8)
(56)Ross А. , Schilgerl К. and Schei- ding W. Celltilase Produchion by Tri- chuderma reesei Fur J.Appl, Microbiol Biotechnol.j 1983, p. 29-37.
Gautam Mitra and Charles R. Wilke. Continuons celluiase production. - Biotechnology and Bioengineering, 1975, 17, p. 1-13.
(54)СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЦЕЛЛЮЛАЗЫ
(57)Изобретение относится к микробио - логической промьшшенности, а именно
к способам непрерьшного культивирования npoflynieHToB целлюлолитических ферментов. С целью повьшения выхода левого продукта и увеличения продук- тивности процесса непрерывное культивирование продуцентов Trichoderma lungibrachiatum BKMF-367, T.viride BKMF-374, T.oureoviride BKMF-2807
на I стадии накопления биомассы ведут на питательном среде, содержащей, мас.%: пшеничные отруби О,3-0,4;хлопковый шрот гидролизованный 0,3-0,4} биомассу гибберсиба 0,45-0,5} одноза- мещенный фосфорнокислый аммоний 0,25- 0,30i сульфат калия 0,20-0,22; сульфат магния 0,025-0,030, воду водопроводную - остальное. На II стадии получения культивирование проводят на гомогенизированной питательной среде, содержащей, мас.%: свекловичный жом 2,5-2,8; пшеничные отруби 0,3-0,4 хлопковый шрот гидролизованный 0,3-0,4; нитрат натрия 0,6- 0,7; сульфат калия 0,25-0,30, фермен- толизат каныги с содержанием редуци- веществ 0,2-0,25 - остальное. В процессе непрерывного культивирования на I стадии получения биомассы рН поддерживают на ypoZiHe 4,0-4,2, а на II стадии получения целлюпазы рН 5,0-5,2, На I стадии непрерывного культивирования питательную среду подают в виде гомогенизата или экстракта. Способ позволяет повысить продуктивность процесса непрерывного культивирования грибов рода Trichoderma в 3-5 раз. 1 з.п. ф-лы, 1 табл.
W
с
О5
:л
СХ)
Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способам непрерывного культивирования продуцентов целлюлолитических ферментов. С целью повышения выхода целевого продукта и увеличения продуктивности процесса непрерывное культивирование продуцентов TRICHODERMA LONGIBRACHIATUM BKMF-367, T.VIRIDE BKMF-374, T.OUREOVIRIDE BKMF-2807 на I стадии накопления биомассы ведут на питательной среде, содержащей, мас.%: пшеничные отруби 0,3-0,4
хлопковый шрот гидролизованный 0,3-0,4
биомассу гибберсиба 0,45-0,5
однозамещенный фосфорнокислый аммоний 0,25-0,30
сульфат калия 0,20-0,22
сульфат магния 0,025-0,030
воду водопроводную - остальное. На II стадии получения культивирование проводят на гомогенизированной питательной среде, содержащей, мас.%: свекловичный жом 2,5-2,8
пшеничные отруби 0,3-0,4
хлопковый шрот гидролизованный 0,3-0,4
нитрат натрия 0,6-0,7
сульфат калия 0,25-0,30
ферментолизат каныги с содержанием редуцирующих веществ 0,2-0,25 - остальное. В процессе непрерывного культивирования на I стадию получения биомассы PH поддерживают на уровне 4,0-4,2, а на II стадии получения целлюлазы PH 5,0-5,2. На I стадии непрерывного культивирования питательную среду подают в виде гомогенизата или экстракта. Способ позволяет повысить продуктивность процесса непрерывного культивирования грибов рода TRICHODERMA в 3-5 раз. 1 з.п. ф-лы, 2 табл.
Изобретение относится .к миробио- логической промьшшенности, а именно к способам непрерывного культивиро- вайия продуцентов целлюполитических ферментов.
Цель изобретения - повышение выхода целевого продукта целлюлазы и увеличение продуктивности процесса.
Непрерывное культивирование продуцентов целлюлазы-грибов рода TriC hoderma ведут в две стадии, причем на I стадии накопления биомассы культивирование осуществляют на питатель Н ой среде, состоящей из пшеничных отрубей, хлопкового гидролизованного Шрота, биомассы гибберсиба, одноза- 1 ещенного фосфорнокислого аммония, сульфата калия и сульфата магния, а на II стадии синтез целлюлазы прово- длт на гомогенизированной питательной среде, состоящей из свекловичного жома, пшеничных отрубей, хлопко- Bjoro гидролизованного шрота, нитрата а|ммония, сульфата калия и ферменто- ; изата каныги, при этом в продессе непрерывного культивирования на I стадии получения биомассы рН поддер- яивают на уровне 4,0-4,2, а на II стадии получения деллюлазы рН 5,0 - ,2. Кроме того, на I стадию непрерывного культивирования питательную среду подают в виде гомогенизата или |кстракта.
: Биохимический состав исходной ка- - отхода мясомолочной промьш - енности, используемой в питательной фреде на II стадии культивирования,% Клетчатка 47,9-48; лигнин 30,47-31) белок 6,7-6,9; жир 6,44-6,8} зола ,46-8,8.
Содержание аминокислот представ- jiieHo в таблице,
Дпя повышения питательной цен- ности и ее усвояемости каныгу обрабатывают ферментом целлюлазы. Полученный ферментолизат каныги обогащают аминокислотами, особенно стимулятора биосинтеза целлюлазы - ас- парагиновой и глутаминовой аминокислотами, содержание редуцирующих веществ достигает 0,6%.
Поддержание рН на I стадии культивирования на уровне 4,0-4,2 позволяет получить качественный посевной материал с выходом по биомассе 99% без наличия посторонней микрофлоры, обеспечивая активный синтез целлюлазы. Значение рН 5,0-5,2, которое поддерживают на II стадии культивирования, соответствует максимальному биосинтезу целлюлазы. Отклонение от предлагаемых значений рН в сторону увеличения или уменьшения как для биомассы, так и для целлюлазы отрицательно сказывается на продуктивности непрерывного процесса на 10-11% относительно оптимальных значений.
Изменение состава среды по представленным концентрациям, изучение зпредельных значений показывает, что нарушение сбалансированной питательной среды по азоту, фосфору, углероду приводит к значительной потере прс дуктивности непрерывного процес- са, составляющей 27-31% относительно оптимальных значений.
Способ непрерывного культивирования осуществляют следующим образом.
Установка для непрерывного культивирования грибов рода Trichuderma состоит из двух ферментеров: первого ферментера объемом 2л и второго ферментера объемом 10 л, при коэффициенте заполнения 0,5. Питательная среда для первого ферментера содержи мас.%: пшеничные отруби 0,3-0,4 J хлоковый гидролизованный шрот О,3-0,4i биомасса гибберсиба 0,45-0,5j одно- замещенный фосфорнокислый аммоний 0,25-0,3 сульфат калия 0,2-0,22; сульфат магния 0,025-0,03J водопроводная вода остальное, для II стади непрерывного культивирования питательная среда содержит, мас.% свекловичный жом 2,5-2,8 пшеничные отруби 0,3-0,4 хлопковый гидролизованный шрот 0,3-0,4 нитрат аммония 0,6 - 0,7; сульфат калия 0,25-0,3, ферментолизат каныги с содержанием редуци- рующих веществ 0,2-0,25 остальное.
16151 786
Культивировацие начинают сначалапитательную среду для непрерывного
во втором ферментере на гомогенизи-культивирования Гьп8 ЬгасЬ арованной среде при 29-30« с с числом-- i. lungibrachia
оборотов мешалки 320 об/мин, аэрации
1 объем воздуха на 1 объем среды, После 4 сут с момента начала биосинтеза целлкшазы включают первый ферментер для наработки биомассы на гомогенизированной среде или ее экстракта при 29-30 С и аэрации 1 объем воздуха на 1 объем питательной среды Через 24 ч роста гриба и максималь- кого накопления биомассы в первом ферментере включают проток из первого ферментера во второй с одновременной подачей питательной среды в первый и второй ферментеры. При этом рН в первом ферментере поддерживают на уровне 4,0-4,2, во втором ферментере 5,0-5,2 аммиачной водой.
Подпитку гомогенизированной питательной среды в обоих ферментерах осуществляют при F 0,05 л/ч, при этом для первого ферментера D
0,05 ч, а для второго ферментера D 0,02
При данном способе непрерывного процесса получения цеплюлазы получают высокопродуктивный процесс составляющий 100-110 ед.. л/ч.
Пример 1, Непрер ывное культивирование гриба Т. longibrachiatum BKMF-367 начинают с периодического культивирования сначала во втором Ферментере при 29-40«С, аэрации 1 объем воздуха на 1 объем среды п 320 об/мин с объемом питательной среды 5 л, содержащей, мас.%: свекловичный жом 2,5 пшеничные отруби 0,3, хлопковый гидролизованный жом 0,3i , 0,6, ,25j фер- ментолизат каныги с содержанием редуцирующих веществ 0,2 остальное.
Ферментолизат каныги готовят следующим образом. 1 г каныги обрабатывают 1%-ным NaOH при 1 атм, 1 ч при гидромодуле 1:20, после этого проtum. Через 4 сут, когда во втором ферментере начинается биосинтез цел- люлазы, включают первый ферментер на гомогенизированной среде следующего состава, мас.%: пшеничные отруби 0,3{ хпопковый гидролизованный пфот О 3 10 биомасса гибберсиба 0,45; (NH4)2HP04 0.25; 0,2; MgS04 0,025; водопроводная вода остальное.
Гидролизат хлопкового шрота готовят следующим образом. Шрот в ко- t5 личестве 4% заливают водой, доводят рН раствора 1 г NaOH до 12, нагревают до 100 С и кипятят 1 ч, после этого расчетное количество (0,3%) гидролизата вводят в состав пита- 20 тельной среды. Биомасса гибберсиба - отход производства гибберсибалино- вой кислоты - стимулятора роста клеток .
Через 24 ч культивирования в пер- 25 вом ферментере при достижении биомассы максимального значения включают проток при D 0,05 для первого ферментера и D 0,02 второго ферментера при одновременной подпитке гомогенизированной питательной среды в первый-и второй ферментеры .с расходом среды 0,05 л/ч.
В условиях непрерывного процесса и установ-ившегося режима (который наступает через 45-50 ч от момента включения протока) для первого ферментера рН поддерживают на уровне 4,0, а для второго ферментёра рН - 5,0 (аммиачной водой).
В условиях установившегося режима среда имеет следующий биохимический состав, мг/л: для первого ферментера - бш1ок.(по Лоури) 1,7; фосфор (общий) 4,0} азот (общий) 0,5/ для второго 45 ферментера - белок (по Лоури) 6 О
фосфор (общий) 2,1; азот (об.ий) 1.1.
При этом продуктивность непрерывного процесса составляет 100 ед /ч по АФБ (активность по фильтровальной
30
35
40
мывают водой до рН 6,0, затем доводят cfl бумаге) гидромодуль цо 1:40 цитратным буферомп
с РН 5,0 и добавляют препарат целло°.ия Р и м е р 2. Непрерывное кульбранин в количестве 0,2 г при 50 С™«ирование осуществляют, по примеру
в течение 30 ч проходит рментолиз °Г ° питательной срезатем отделяют жидкую фракцию Т ° ьзуют следующий состав, масЛ: ментолизат с содержа ием ре д цирую х рубТГз - ФеРментера - пшеничные веществ 0,6%. полученный ферментоГ ньй от оЧ бГ ™ДР° изованзат каныги разбавляют водой до со-О 5 (т Tf гибберсиба
держания РВ 0,2% и готовят на нейMgSO. °
MgbU(.u,93, для второго ферментера культивирования Гьп8 ЬгасЬ а-- i. lungibrachia
tum. Через 4 сут, когда во втором ферментере начинается биосинтез цел- люлазы, включают первый ферментер на гомогенизированной среде следующего состава, мас.%: пшеничные отруби 0,3{ хпопковый гидролизованный пфот О 3 10 биомасса гибберсиба 0,45; (NH4)2HP04 0.25; 0,2; MgS04 0,025; водопроводная вода остальное.
Гидролизат хлопкового шрота готовят следующим образом. Шрот в ко- t5 личестве 4% заливают водой, доводят рН раствора 1 г NaOH до 12, нагревают до 100 С и кипятят 1 ч, после этого расчетное количество (0,3%) гидролизата вводят в состав пита- 20 тельной среды. Биомасса гибберсиба - отход производства гибберсибалино- вой кислоты - стимулятора роста клеток .
Через 24 ч культивирования в пер- 25 вом ферментере при достижении биомассы максимального значения включают проток при D 0,05 для первого ферментера и D 0,02 второго ферментера при одновременной подпитке гомогенизированной питательной среды в первый-и второй ферментеры .с расходом среды 0,05 л/ч.
В условиях непрерывного процесса и установ-ившегося режима (который наступает через 45-50 ч от момента включения протока) для первого ферментера рН поддерживают на уровне 4,0, а для второго ферментёра рН - 5,0 (аммиачной водой).
В условиях установившегося режима среда имеет следующий биохимический состав, мг/л: для первого ферментера - бш1ок.(по Лоури) 1,7; фосфор (общий) 4,0} азот (общий) 0,5/ для второго 5 ферментера - белок (по Лоури) 6 О
фосфор (общий) 2,1; азот (об.ий) 1.1.
При этом продуктивность непрерывного процесса составляет 100 ед /ч по АФБ (активность по фильтровальной
30
35
0
бумаге) п
свекловичный жом 2,8; пшеничные отруби 0,4, хлопковый гидролизованный шрот 0,4; ,,- 0,3 фер ментолизат каныги с содержанием ре- дуцирую1цих веществ 0,25 остальное.
В установившемся режиме в первом .ферментере рН поддерживают на уровне 3,2, а во втором ферментере - на уровне 5,2, Продуктивность непрерывного процесса 110 ед/л/ ч.
Пример 3, Аналогично пример 1, но на стадии получения биомассы в первом ферментере используют экстрак питательной среды, а не гомогенизат, :при этом продуктивность непрерывного процесса составляет 94 ед,«л/ч. ; П р и м ,е р 4, Непрерывное куль- |тивирование осуществляют по примеру 1, только в качестве питательной среды используют следующий состав, мас.%: для первого ферментера - пше- |ничные отруби. 0,35; хлопковый гидро- пизованный uipoT 0,35; биомасса гиб- 1берсиба 0,48; (NH). 0,28 Ю,21 MgSP4 0,28J для второго ферментера - свекловичный жом 2,65| ;пшеничные отруби 0,35, хлопковый гид :ролизованный шрот 0,35 з 0,65; . 0,28, ферментолизат каныги с содержанием редуцирующих веществ 6522 остальное. Продуктивность непре рывного процесса составляет 100 ед. Л/ :по АФБ.:
П р .н м е р 5, Аналогично примеру 15 но в качестве продуцента используют штамм Т, vi ride. BKMF-374. Продуктивность непрерывного процесса по АФБ составляет 130 ед. Л/ч, i Пример 6, Аналогично приме- |ру 1, но в качестве продуцента испол зуют штамм Т, longibracViiatum BKMF- :367 и T,oureoviride BKMF-2807. Продуктивность непрерывного процесса по АФБ составляет 104 ед,Л/ч,
Предлагаемый способ получения цел люлазы позволяет повысить продуктивность процесса непрерывного культивирования продуцентов-грибов рода Trichoderma в 3-5 раз по сравнению, с известным способом.
Формула изобретения
0
5
0
5
0
5
0
накопления биомассы источник углерода и воду, а на II стадии - источник целлюлазы и воду до максимального накопления ферментов, о г- личающийся тем, -что, с целью повышения выхода целевого продукта и увеличения продуктивности процесса, непрерывное культивирование на I стадии накопления биомассы ведут на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода пшеничные отруби и дополнительно гидролизованный хлопковый шрот, биомассу гибберсиба, однозамещенный фосфорнокислый аммоний, сульфат калия, сульфат магния при следующем соотношении компонентов, мас.%: Пшеничные отруби Хлопковый гидролизованныйшрот
Биомасса гибберсиба
Однозамещенный фосфорнокислый аммоний Сульфат калия Сульфат магния Вода водопроводная
при этом поддерживают рН на уровне 4,0 - 4,2, а на II стадии синтез целлюлазы ведут на гомогенизированной питательной среде, содержащей в качестве источника целлюлазы свекловичный жом и ферментолизат каныги с содержанием редуцирующих веществ 0,20-0,25, а также дополнительно пшеничные отруби, хлопковый гидролизованный шрот азотнокислый аммоний при следующем соотношении компонентов, мас.%:
0,3-0,4
0,3-0,4 0,45-0,50
0,25-0,30
0,20-0,22
0,025-0,030
Остальное
5
0
Свекловичньй жом Пшеничные отруби Хлопковый гидролизованныйшрот
Азотнокислый аммоний Сульфат калия Ферментолизат каныги с содержанием редуцирующих веществ
Вода водопроводная
2,5-2,8 0,3-0,4
0,3-0,4
0,6-0,7 0,25-0,30
0,20-0,25
Остальное
при этом рН поддерживают на уровнеду подают на I стадию непрерывного
культивирования в виде гомогенизата
