СПОСОБ КРИОКОНСЕРВАЦИИ СПЕРМЫ ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2005 года по МПК A01N1/02 

Предлагаемое изобретение относится к области криобиологии и криомедицины и может использоваться в медицинских учреждениях во вспомогательных репродуктивных технологиях при лечении различных форм бесплодия.

Обеспечение условий для сохранения репродуктивного здоровья является одним из важнейших критериев стратегии развития общества. Известно, что репродуктивный процесс может быть нарушен факторами внешней среды, к числу которых можно отнести стресс, ухудшающиеся социально-экономические условия, неблагоприятную инфекционно-эпидемиологическую обстановку, химические вещества и физические воздействия. В связи с бурным развитием новых промышленных технологий два последних фактора являются наиболее опасными. Демографические показатели свидетельствуют о формировании в России устойчивой тенденции к старению населения, возрастанию в его структуре удельного веса людей пожилого и старческого возраста. Эти тенденции в сочетании с повышением нынешних требований к уровню качества жизни в целом и половой жизни в частности обусловливают высокую актуальность изучения бесплодия у мужчин.

Прогресс в лечении указанной патологии в последнее десятилетие в определенной мере связан с применением криометодов в коррекции последствий этого заболевания. Именно поэтому криоконсервация репродуктивных клеток человека стала сейчас одной из актуальных проблем современной криобиологии. Разработка новых методов криоконсервации спермиев человека необходима для создания криобанков этих клеток, так как только наличие запасов полноценных гамет может обеспечить потребности клинической медицины в этом виде биологического материала. Имеющееся в наличии достаточное количество криоконсервированных спермиев является единственной возможностью иметь детей людям с заболеваниями репродуктивной системы, параплегией, прогрессирующей мышечной дистрофией, миастенией gravis, множественным склерозом и др. Организация криобанков спермы человека решает проблему рождения полноценных детей при занятости родителей в опасных отраслях производства науки и техники, связанных с возможностью лучевого поражения, химической интоксикации и другими неблагоприятными воздействиями. Инсеминация криоконсервированной спермой используется также при хирургических операциях на половых органах, вынужденно или сознательно (стерилизация) приводящих к бесплодию. Криобанки спермы дают также возможность контроля качества эякулятов, что имеет актуальное значение в связи с увеличением зон повышенной радиации и ухудшающейся эпидемиологической обстановкой. Несмотря на имеющийся прогресс в проблеме низкотемпературного хранения спермы человека, традиционно применяемые способы криоконсервации этих клеток недостаточно эффективны.

Известен способ криоконсервации спермиев человека (Белоус А.М., Грищенко В.И., Паращук Ю.С. Криоконсервация репродуктивных клеток. Киев: Наукова Думка, 1986. - 207 с.), в котором к спермиям добавляют глицерин до конечной концентрации 10%. Образцы разливают в стеклянные ампулы, запаивают и охлаждают сначала со скоростью 25°С/мин до минус 75°С, а затем со скоростью 16°С/мин до минус 196°С. Пробы отогревают при комнатной температуре. Выживаемость после отогрева находится в пределах 60%.

Недостатком этого способа является ступенчатость охлаждения образца и как следствие его трудоемкость, а также низкая выживаемость клеток после отогрева.

Известен способ криоконсервации спермиев (Белоус A.M., Грищенко В.И., Паращук Ю.С. Криоконсервация репродуктивных клеток. Киев: Наукова Думка, 1986. - 207 с.). В данном способе под защитой 10% глицерина образцы охлаждали со скоростью 1°С/мин до 5°С, затем сперму экспонировали при этой температуре 30 мин и далее охлаждали со скоростью 20-25°С/мин до минус 196°С. Выживаемость спермиев, криоконсервированных по этой методике, составила 67,1%.

Недостатком данного способа следует считать этап эквилибрации спермиев при температуре 5°С. На этом этапе наиболее сильно проявляется цитотоксическое действие на клетки высокой концентрации криопротектора, используемого в данном способе.

Известен способ криоконсервации спермы человека, включающий замораживание разбавленной глюкозо-цитратно-желточной средой спермы в присутствии глицерина, в котором для повышения выживаемости спермиев замораживание ведут в 1,5-2,5%-ном глицерине и в среде порошка окиси алюминия (Грищенко В.И., Калугин Ю.В., Паращук Ю.С., Лучко Н.А., Черныш Е.Н., Тарасов В.Ф., Гальченко С.Е. Способ криоконсервирования спермы человека. А.с. 1660651 РФ, МКИ A 01 N 1/00; A 61 B 17/36. Опубл. в Б.И. 07.07.1991).

Недостатком данного способа является использование контейнеров из алюминиевой фольги, нетоксичных, апирогенных, однако не герметичных. При хранении образцов в алюминиевые контейнеры попадает жидкий азот, что приводит при размораживании к его разрыву и утрате образца.

Известен еще один способ криоконсервации спермы тех же авторов, что и предыдущий аналог (Грищенко В.И., Калугин Ю.В., Паращук Ю.С., Лучко Н.А., Черныш Е.Н., Тарасов В.Ф., Гальченко С.Е. Способ низкотемпературного консервирования спермы. Патент 4965186, США).

Недостатком данного способа, наряду с использованием контейнеров из алюминиевой фольги, является малый объем замораживаемого образца - 0,3-0,5 мл. Такой объем отогретой суспензии репродуктивных клеток невозможно использовать в целом ряде процедур вспомогательных репродуктивных технологий.

За прототипом предлагаемого изобретения выбран способ криоконсервации спермы человека, включающий добавление к сперме криозащитной среды, помещение полученного биоматериала в одноразовые контейнеры и замораживание с использованием паров жидкого азота (Glassman А.В., Karow A.M., Benett C.E. The effects of cryopreservation and long distance transportation on human spermatozoa // Cryobiology. - 1979. - 16, № 6. - P.615). В этом способе к сперме добавляли глицерин по 100 мкл через каждые 15 секунд до 15% концентрации. Охлаждение осуществляли в контейнерах в виде поливиниловых ампул, которые после 30-минутной инкубации при +4°С замораживали в парах жидкого азота в течение 10 минут. Это позволило достичь 65% выживаемости спермиев после их отогрева.

Недостатком данного способа является длительный подготовительный период, высокая концентрация криопротектора в среде замораживания и низкая выживаемость клеток после отогрева.

Подводя итог описанию известных способов, следует сказать, что недостатками прототипа, как и всех описанных выше аналогов, является низкая выживаемость клеток после отогрева (60-67%). Кроме того, как показали исследования авторов предлагаемого изобретения, подвижность отогретых спермиев человека при использовании известных способов находится в пределах 23±2,0%, а частота наступления беременности после оплодотворения криоконсервированной спермой доноров - в пределах 11,8-21,2% (в зависимости от возраста женщин). Следует также отметить, что перечисленные низкие показатели наблюдаются на фоне таких чисто технических недостатков известных способов, как трудоемкость, многоступенчатость и чрезмерная продолжительность.

В задачу предлагаемого изобретения положено: повышение выживаемости и подвижности спермиев (по завершении криоконсервации и отогрева); повышение частоты наступления беременности после оплодотворения криоконсервированной спермой; а также снижение трудоемкости и продолжительности способа.

Поставленная задача в способе криоконсервации спермы человека, включающий добавление к сперме криозащитной среды, помещение полученного биоматериала в одноразовые контейнеры и замораживание с использованием паров жидкого азота, достигается тем, что используют криозащитную среду следующего состава:

Монометиловый эфир глицерина 2% - 20 мл

Трис - HCL буфер рН 7,8 - 100 мМ

Этилендиаминтетрауксусная кислота - 1 мМ

MgCl₂·6Н₂O - 2 мМ

Лецитин - 40-45 г

Каннамицина сульфат 500000 ед. - 0,2 г

Вода дистиллированная - до 1000 мл

К сперме добавляют криозащитную среду в соотношении 1:1, и полученный биоматериал помещают в контейнеры объемом 0,5-1 мл, изготовленные из двухкомпонентной полимерной пленки толщиной 0,3-0,5 мл, состоящей из тефлона и полиамида, замораживание проводят сверхбыстрыми со скоростями 3000-5000 К/мин, для чего контейнеры с биоматериалом выдерживают 10-15 мин в струе паров жидкого азота, а затем погружают в жидкий азот на все время хранения, причем по завершении хранения отогрев проводят на водяной бане при температуре 39-41°С.

В основе способа лежит идея избежать образования на поверхности контейнера пленочного кипения хладагента, что достигается путем увеличением скорости охлаждения образца до 3000-5000 К/мин и использованием криоконсерванта, который содействует развитию витрификации. При использовании другого диапазона скоростей будет развиваться кристаллизация.

Основным побудительным мотивом использования витрификации при замораживании репродуктивных клеток явилось убеждение, что витрификация считается идеальным состоянием льда для обеспечения сохранности биологических объектов при низких температурах. Только при использовании витрификации удается избежать необратимых изменений в ультраструктуре клеток, причиненных образованием внутриклеточных кристаллов льда, что достигается использованием витрифицирующих растворов и специальных способов снижения температуры.

В предлагаемом способе обеспечивается такой комплекс условий, который способствует максимальному сохранению жизнедеятельности и оплодотворяющих свойств мужских репродуктивных клеток, за счет чего, в конечном итоге, и повышается выживаемость спермиев (до 85%), подвижность (до 47±3,0%) и частота наступления беременности после оплодотворения этой спермой (до 61,9-72,4%). Существенными признаками для обеспечения такого эффекта являются приведенные в формуле изобретения признаки, которые относятся к скорости охлаждения, порядку проведения охлаждения и отогрева, составу криозащитной среды и использованию специальных контейнеров.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом.

Для криоконсервации спермы по предлагаемому способу в условиях сверхбыстрых скоростей охлаждения применяют контейнеры, изготовленные из двухкомпонентной полимерной пленки, состоящей из тефлона и полиамида, нетоксичной, толщиной 0,3·10^-5 м, рассчитанные на объем 0,5-1 мл. Контейнеры стерилизуют в сушильном шкафу при 160°С в течение 1,5 часа, маркируют и после помещения в них биоматериала свободную сторону запаивают.

Отличие используемых в предлагаемом способе одноразовых, апирогенных контейнеров от существующих заключается в их полной герметичности, прозрачности (возможность оценки образца, не вскрывая контейнера), рассчитанных оптимальных размерах, соответствующих скорости охлаждения образца и возможности стерилизации при высокой (160°С) температуре без потери материалом контейнера своих свойств.

Применяемые в предлагаемом способе контейнеры обеспечивают возможность оптимальных температурных условий стерилизации, замораживания и отогрева, т.к. выдерживают без повреждения все эти температуры и при этом способствуют оптимальной теплоотдаче и не допускают проникновение сверхтекучего жидкого азота. Материал, из которого изготовлены контейнеры, толщина материала, объем контейнеров подбирались в ходе длительных специальных исследований.

Взятую для криоконсервации сперму сначала соединяют с криозащитной средой. В качестве криозащитной среды используют раствор следующего состава:

Монометиловый эфир глицерина 2% - 20 мл

Трис - HCL буфер рH 7,8 - 100 мМ

Этилендиаминтетрауксусная кислота - 1 мМ

MgCl₂·6Н₂O - 2 мМ

Лецитин - 40-45 г

Каннамицина сульфат 500000 ед. - 0,2 г

Вода дистиллированная - до 1000 мл

Состав криозащитной среды подобран в ходе длительных специальных экспериментов. Криозащитная среда добавляется к образцу в соотношении 1:1.

При использовании более концентрированной криозащитной среды будет проявляться цитотоксический эффект, который выражается в снижении морфофункциональных свойств клеток после отогрева. При использовании более разбавленного раствора эффект витрификации достигаться не будет.

Полученный таким образом биоматериал помещают в предварительно просте-рилизованные контейнеры, после чего свободный конец контейнеров запаивают.

Сверхбыстрое охлаждение замораживаемых образцов достигается путем выдерживания контейнеров в струе паров жидкого азота в течение 10-15 минут, с последующим погружением их в жидкую фазу (т.е. в жидкий азот) на все время хранения (которое определяется специальными нормативными актами МЗ РФ).

По завершении криоконсервации отогрев проводят на водяной бане при температуре 39-41°С. При t 39-41°С были получены оптимальные результаты. При температуре больше, 41°С отмечалось повышенное количество погибших в связи с денатурацией белковых структур клеток. При температуре меньше, чем 39°С, в размораживаемом биоматериале проходят рекристаллизационные процессы, т.е. наблюдается образование кристаллов льда, ведущее к разрыву и нарушению внутренних структур клеток.

Примеры конкретных исполнений

Пример № 1

Для криоконсервации отбирали эякуляты от доноров при нормоспермии, которые удовлетворяли следующим критериям: объем более 1 мл, содержание в 1 мл эякулята более 80·10⁶ клеток, доля прогрессивно-подвижных форм (А+В) более 60%, доля морфологически нормальных форм более 60%, криотолерантность.

Криоконсервацию проводили по предлагаемому способу. Для этого к сперме добавляли криозащитную следующего состава:

Монометиловый эфир глицерина 2% - 20 мл

Трис - HCL буфер рH 7,8 - 100 мМ

Этилендиаминтетрауксусная кислота - 1 мМ

MgCl₂·6Н₂O - 2 мМ

Лецитин - 40-45 г

Каннамицина сульфат 500000 ед. - 0,2 г

Вода дистиллированная - до 1000 мл

Криозащитную среду добавляли к образцу в соотношении 1:1.

Полученный таким образом биоматериал помещали в предварительно простерилизованные в сушильном шкафу при 160°С в течение 1,5 часа контейнеры, изготовленные из двухкомпонентной полимерной пленки, состоящей из тефлона и полиамида, толщиной 0,3·10^-5 м, рассчитанные на объем 0,5-1 мл. Свободный конец контейнеров запаивали. Контейнер выдерживали в струе паров жидкого азота в течение 10 минут с последующим погружением в жидкий азот на все время хранения. Отогрев проводили на водяной бане при t41°С.

В таблице 1 приведены данные по подвижности спермиев, криоконсервированных предлагаемым способом и прототипом.

Таблица 1
Подвижность отогретых спермиев человека криоконсервированных с использованием стандартной методики замораживания (прототип) и со сверхбыстрыми скоростями охлаждения (предлагаемый способ) (М±m, n=6)Способ замораживанияНативная суспензия
Подвижность, %Криоконсервированная суспензия
Подвижность, %Предлагаемый способ52±8,047±3,0Стандартный способ замораживания
(способ-прототип)52±8,023±2,0^** - достоверность различий по отношению к показателю нативной суспензии; р<0.05.

Как видно из данных таблицы, подвижность отогретых спермиев выше при замораживании с использованием сверхбыстрых скоростей охлаждения

Пример № 2

Для криоконсервации по предлагаемому способу использовались спермин, полученные от доноров. Женщинам по показаниям делалась искусственная инсеминация криоконсервированной спермой донора. Результаты исследований представлены в таблице 2.

Таблица 2
Частота наступления беременности после оплодотворения криоконсервированной спермой доноров.СПОСОБ ЗАМОРАЖИВАНИЯЧастота наступления беременности, %До 25 лет25 -35 летПредлагаемый способ72,461,9Стандартный способ замораживания (прототип)21,211,8

Как видно из данных таблицы, при использовании нашего способа замораживания, частота наступления беременности была выше.

Пример № 3

Для криоконсервации по предлагаемому способу отбирали эякуляты от доноров при нормоспермии, которые удовлетворяли следующим критериям: объем более 1 мл, содержание в 1 мл эякулята более 80·10⁶ клеток, доля прогрессивно-подвижных форм (А+В) более 60%, доля морфологически нормальных форм более 60%, криотолерантность. Отогрев проводили на водяной бане при 40°С. Данные результатов замораживания-отогрева клеточной суспензии представлены в таблице 3.

Таблица 3
Выживаемость спермиев человека при криоконсервации стандартным способом (прототип) и при использовании сверхбыстрых скоростей охлаждения (предлагаемый способ).СПОСОБ ЗАМОРАЖИВАНИЯВЫЖИВАЕМОСТЬ, %Предлагаемый способ85Стандартный способ замораживания (прототип)60

Из данных таблицы видно, что при криоконсервации с использованием сверхбыстрых скоростей охлаждения выживаемость спермиев достоверно выше.

Действие сверхвысоких (3000-5000 К/мин) скоростей охлаждения (предлагаемый способ), являющихся оптимальными для репродуктивных клеток, связано с наилучшим дегидратационным эффектом, являющимся необходимой предпосылкой предупреждения развития внутриклеточной кристаллизации. Наряду с этим криозащита спермиев, криоконсервированных по данному способу, обусловлена суммой свойств компонентов криоконсерванта, направленных на нейтрализацию "эффекта раствора", возникающего в этих условиях. В связи с морфофункциональными особенностями спермиев максимальная сохранность их при криоконсервации достигается оптимальным сочетанием температурного режима охлаждения с низким концентрационным диапазоном криопротектора.

Изобретение относится к криобиологии и криомедицине. Способ включает добавление к сперме криозащитной среды и замораживание с использованием паров жидкого азота, с использованием сверхвысоких скоростей замораживания, состава криозащитной среды, включающей эфир глицерина, трис буфер, ЭДТА, лецитин, каннамицин сульфат и воду, и специальных контейнеров. Способ позволяет значительно повысить выживаемость, подвижность спермиев и увеличить частоту наступления беременности после оплодотворения криоконсервированной по предлагаемому способу спермой. 1 з.п. ф-лы, 3 табл.

1. Способ криоконсервации спермы человека, включающий добавление к сперме криозащитной среды, помещение полученного биоматериала в одноразовые контейнеры и замораживание с использованием паров жидкого азота, отличающийся тем, что используют криозащитную среду следующего состава:

Монометиловый эфир глицерина 2%20 млТрис - HCL буфер рн 7,8100 мМЭтилендиаминтетрауксусная кислота1 мМMgCL₂·6Н₂О2 мМЛецитин40-45 гКаннамицина сульфат 500000 ед.0,2 гВода дистиллированнаяДо 1000 мл,

к сперме добавляют криозащитную среду в соотношении 1:1 и полученный биоматериал помещают в контейнеры объемом 0,5-1 мл, изготовленные из двухкомпонентной полимерной пленки толщиной 0,3-0,5 мл, состоящей из тефлона и полиамида, замораживание проводят со сверхбыстрыми скоростями 3000-5000 К/мин, для чего контейнеры с биоматериалом выдерживают 10-15 мин в струе паров жидкого азота, а затем погружают в жидкий азот на все время хранения, причем по завершении хранения отогрев проводят на водяной бане при температуре 39-41°С.