СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ЭПИДЕМИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫХ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ VIBRIO ELTOR И VIBRIO CHOLERAE O139 ПО ИХ АДГЕЗИВНОЙ СПОСОБНОСТИ Российский патент 2008 года по МПК C12Q1/04 C12R1/63 

Предлагаемое изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано в лабораторной диагностике для экспрессного исследования штаммов холерных вибрионов Vibrio eltor и Vibrio cholerae О139 (Бенгал).

Одним из главных вопросов эпидемиологического надзора при холере является оценка эпидемической значимости выделяемых культур холерных вибрионов, существующих в виде токсигенных негемолитичных штаммов, которые выявляются на эритроцитах барана по Грейгу и определения гена холерного токсина в полимеразной цепной реакции (ПЦР) холерогенность на кроликах-сосунках. ПЦР и определение холерогенности на животных трудоемко, дорогостояще и доступно не всем лабораториям. В связи с чем поиск новых простых экспресс-методов выявления токсигенных штаммов in vitro является актуальной проблемой.

Известен способ определения адгезивной способности вибрионов с использованием эритроцитов (см. С.Г.Саппо, Л.Я.Урбанович, B.C.Колесник «Использование эритроцитов для выявления адгезивной способности вибрионов» сборник «Современные аспекты профилактики зоонозных инфекций», Министерство здравоохранения СССР, Иркутск, 1984 г., стр.126-127), заключающийся в использовании эритроцитов кролика, для этого готовили мазки из взвеси испытуемой культуры вибриона и эритроцитов и проводили окраску по Романовскому-Гимза и прочным зеленым - с докраской азуром II, затем по каждому штамму «прилипшие» вибрионы сосчитывали на 100 эритроцитах и определяли среднее количество «прилипших» вибрионов на один эритроцит.

Однако, не смотря на то, что показатели дают возможность определять достоверно вирулентность штаммов по их адгезивной способности, но не позволяют провести дифференциацию штаммов по их эпидемической значимости. Кроме того, сам процесс является трудоемким и дорогим, так как требует содержания животных

За прототип выбран способ определения адгезивной способности холерных вибрионов (см. авт. св. СССР №1306107, кл. С12N 1/00, С12Q 1/02, Бюл. 24, 30.06.90 г.) путем использования в качестве субстрата крови кролика, взвесь которого в объеме 0,5-1% инкубируют с исследуемой культурой и взятых в равных объемах, в течение 25-40 мин.

Недостатком прототипа является то, что использование эритроцитов кролика выявляет наличие адгезивной способности вибрионов с различной вирулентностью, причем к последним могут относиться штаммы и не продуцирующие холероген, что не отражает корреляции с основными факторами эпидемической значимости, а именно, токсигенностью и гемолитичностью, то есть быстрого экспрессного отображения наличия гена холерного токсина и гемолиза эритроцитов при отсутствии последнего.

Техническим результатом заявляемого способа является экспрессное определение эпидемической значимости штаммов холерных вибрионов Vibrio eltor и Vibrio cholerae О139 «Бенгал», а именно, быстрое обнаружение как токсигенных, так и гемолитичных штаммов холерных вибрионов.

Указанный технический результат достигается тем, что в известном способе определения токсигенности холерных вибрионов Vibrio eltor и Vibrio cholerae О139 по их адгезивной способности, включающем инкубирование исследуемой культуры с последующим приготовлением микроскопических препаратов и определением адгезивной способности по количеству приклеившихся вибрионов к субстрату, причем в качестве последнего используют II группу крови человека, которую дефибринируют, трижды отмывают, центрифугируя при 3000 об/мин в течение 15 минут с 0,9% NaCl pH 7,2, полученные эритроциты разводят физиологическим раствором в соотношении 1:8, затем ставят реакцию на стекле, нанося по одной капле 1 млрд взвеси агаровой культуры холерных вибрионов и одну каплю 8% эритроцитов, после этого помещают мазки на 20 минут во влажную камеру и проводят инкубирование последних при 37°С с последующим приготовлением для микроскопических исследований, при этом по результатам реакции осуществляют дифференциацию, если средний показатель адгезии - СПА>1,5, то исследуемый штамм холерного вибриона токсигенен - эпидемически значимый, а если СПА<1,5, то эритроциты лизированы, имеют красный цвет, следовательно, штамм атоксигенен, гемолитичен и не имеет эпидемической значимости.

Способ осуществляется следующим образом.

Нативную человеческую кровь II группы дефибринируют, трижды центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 минут отмывают с 0,9% фосфатно-буферным раствором pH 7,2. Надсадочную жидкость удаляют, отмытые эритроциты разводят стерильным физиологическим раствором в соотношении 1:8, а именно 0,8 мл эритроцитов и 9,2 мл NaCl.

Затем из 18-ти часовой агаровой культуры холерных вибрионов готовят 1 млрд взвесь по стандарту мутности ОСО ГИСК им. Тарасевича.

На предметное стекло наносят по капле 1 млрд взвеси культуры и 1 каплю 8% эритроцитов. Стекло помещают во влажную камеру на 20 мин, после в термостат с температурой 37°С. После этого мазки подсушивают на воздухе, фиксируют 96° спиртом в течение 20 минут, окрашивают по Романовскому-Гимза метиленовым синим 20 минут, стекла промывают трижды дистиллированной водой.

Адгезивную способность оценивают по среднему показателю адгезии (СПА), который определяют с помощью светового микроскопа из расчета общего количества вибрионов, прикрепившихся на 100 эритроцитов.

где СПА - среднее количество вибрионов, прикрепившихся к одному эритроциту.

По результатам реакции делают дифференциацию. Если СПА<1,5 и имеет место гемолиз эритроцитов, который фиксируется в мазке визуально (т.к. эритроциты увеличены в размере, имеют красный цвет и не правильную форму), то делают вывод о том, что штамм нетоксигенный, гемолитичный и не имеет эпидемической значимости.

Пример 1.

В качестве исследуемого штамма используют культуру V. cholerae О139 «Бенгал» 16131 (ctx⁺ Hly^-) и 17781 (ctx^- Hly⁺). В качестве субстрата используют эритроциты I, II, III, IV групп крови человека (см. таблицу 1).

Из таблицы 1 видно, что наиболее демонстративно разница между токсигенными и нетоксигенными штаммами «Бенгал» на II группе крови человека, так как для штамма 16131-СПА (0,5), а для штамма 17781-СПА (1,1). На III группе дифференциации по адгезии нет. На I и IV группах дифференциация менее демонстративна, чем на II группе крови. Кроме того, гемолитический штамм «Бенгал» 17781 имеет не только самый низкий СПА (1,1), но и лизис эритроцитов, фиксирующийся визуально в мазке, где эритроциты имеют красный цвет, увеличены в размерах и имеют неправильную форму. Таким образом, штамм «Бенгал» 17781 - нетоксигенен и не имеет эпидемической значимости.

Штамм «Бенгал» 16131 имеет ген холерного токсина, т.к. на II группе крови самый высокий СПА (5,0), что наиболее демонстративно при дифференциации. Гемолиза эритроцитов в мазке не наблюдается, т.е. эритроциты окрашены в синий цвет, имеют правильную круглую форму и не увеличены в размерах. Следовательно, данный штамм имеет ген холерного токсина холерного вибриона, поэтому он представляет эпидемическую опасность, что подтверждено с помощью ПЦР-анализа.

Пример 2.

В качестве исследуемого штамма используют культуру V. cholerae eltor 5879 (ctx^- Hly⁺). В качестве субстрата используют эритроциты I, II, III, IV групп крови человека и штамм V. cholerae eltor 14863 (ctx^- Hly⁺) (см. таблицу 2).

Из таблицы 2 наблюдаем демонстративную разницу между токсигенными и нетоксигенными штаммами V. cholerae eltor также на II группе крови человека. На IV группе закономерной дифференциации не наблюдается. Не выражена она на I и III группах. На II группе крови гемолитический штамм V. cholerae eltor 14863 имеет низкий СНА (0,6) и лизис эритроцитов, фиксирующийся визуально в виде лизированных эритроцитов красного цвета, что подтверждает отсутствие эпидемической значимости.

Штамм V. cholerae eltor 5879, имеющий ген холерного токсина (ctx), обладает высокой адгезивностью (СПА=7,3) и отсутствие гемолиза. По результатам адгезии можно сделать вывод о том, что штамм токсигенный и не гемолитичный, а следовательно, эпидемически значимый, что подтверждено с помощью ПЦР-анализа при выявлении гена холерного токсина.

Пример 3.

В качестве исследуемых штаммов используют культуры V. cholerae eltor 5879, V. cholerae eltor 14863 (ctx^- Hly⁺), V. cholerae 0139 «Бенгал» 16131 (ctx⁺ Hly^-) и 17781 (ctx^- Hly⁺). В качестве субстрата используют эритроциты барана и кролика (см. таблицу 3).

Из таблицы 3 видно, что адгезия к эритроцитам барана и кролика не является дифференциальным признаком между токсигенными и нетоксигенными штаммами V. cholerae eltor и V. cholerae 0139 «Бенгал».

Таким образом, негемолитические штаммы, которые в основе своей являются токсигенными, имеют высокий индекс адгезии.

Из проведенных экспериментов специалистами Ростовского НИПЧИ установлено, что адгезия на эритроцитах кролика и барана не отражает и токсигенности и атоксигенности штаммов холерных вибрионов. Все штаммы хорошо адгезируются не зависимо от наличия или отсутствия гена холерного токсина и гемолитичности, имеют высокий показатель адгезии, СПА>2, но не наблюдается закономерной дифференциации между атоксигенными и токсигенными штаммами. Наличие гена холерного токсина по среднему показателю адгезии можно определить на I, II и III группах крови человека, однако, на II группе разница СПА между токсигенными и атоксигенными наиболее демонстративна (токсигенные - 5; атоксигенные - 0,6) и в мазке виден гемолиз эритроцитов.

Таким образом предлагаемое изобретение позволяет экспрессно определять эпидемическую значимость холерных вибрионов Vibrio eltor и Vibrio cholerae О139 «Бенгал».

Таблица 1Штамм №Наличие гена ctx (в ПЦР) и гемолиза в пробе ГрейгаСПА на эритритроцитах человека группы крови и гемолизIгемолизIIгемолизIIIгемолизIVгемолиз16131 «Бенгал»ctx⁺ Hly^-2,3-5,0-1,8-2,6-17781 «Бенгал»ctx^- Hly⁺1,9-1,1+1,2-1,4-

Таблица 2Штамм №Наличие гена ctx (в ПЦР) и гемолиза в пробе ГрейгаСПА на эритритроцитах человека и гемолизIгемолизIIгемолизIIIгемолизIVгемолизV. cholerae eltor 5879сtx⁺ Hly^-2,3-7,3-2-0,8-V. cholerae eltor 14863ctx^- Hly⁺1,37-0,6+1,75-1,3-

Таблица 3Штамм №Наличие гена ctx (в ПЦР) и гемолиза в пробе ГрейгаСПА на эритроцитахбаранакроликаV. cholerae eltor 5879ctx⁺ Hly^-4,83,8V. cholerae eltor 14863ctx^- Hly+1,384V. cholerae O139 «Бенгал»16131ctx⁺ Hly^-42V. cholerae O139 «Бенгал» 17781ctx^- Hly+3,63,4

Сущность способа заключается в том, что в качестве субстрата, к которому прикрепляются холерные вибрионы, используют II группу крови человека, последнюю дефибринируют, трижды отмывают, центрифугируя при 3000 об/мин в течение 15 минут с 0,9% NaCl pH 7,2. Полученные эритроциты разводят физиологическим раствором в соотношении 1:8, затем ставят реакцию на стекле, нанося по одной капле 1 млрд взвеси агаровой культуры холерных вибрионов и одну каплю 8% эритроцитов. Мазки помещают на 20 минут во влажную камеру и проводят инкубирование последних при 37°С с последующим приготовлением для микроскопических исследований. По результатам реакции осуществляют дифференциацию: если средний показатель адгезии - СПА>1,5, то исследуемый штамм холерного вибриона токсигенен - эпидемически значимый, а если СПА<1,5, то эритроциты лизированы, имеют красный цвет и штамм атоксигенен, гемолитичен и не имеет эпидемической значимости. Изобретение может быть использовано в лабораторной диагностике для экспрессного исследования штаммов холерных вибрионов Vibrio eltor и Vibrio cholerae О139 (Бенгал) для обнаружения эпидемически значимых, токсигенных и атоксигенных, гемолитичных штаммов. 3 табл.

Способ выявления эпидемически значимых холерных вибрионов V. cholerae eltor и V. cholerae О139, включающий инкубирование исследуемой культуры с последующим приготовлением микроскопических препаратов и определением адгезивной способности по количеству прикрепившихся вибрионов к субстрату, отличающийся тем, что в качестве субстрата используют II группу крови человека, которую дефибринируют, трижды отмывают, центрифугируя при 3000 об/мин в течение 15 мин с 0,9% NaCl pH 7,2, полученные эритроциты разводят физиологическим раствором в соотношении 1:8, затем ставят реакцию на стекле, нанося по одной капле 1 млрд. взвеси агаровой культуры холерных вибрионов и одну каплю 8% эритроцитов, после этого размещают мазки на 20 мин во влажную камеру и проводят инкубирование последних при 37°С с последующим приготовлением для микроскопических исследований, при этом по результатам реакции делают дифференциацию, если средний показатель адгезии СПА>1,5, то исследуемый штамм холерного вибриона токсигенен - эпидемически значимый, а если СПА<1,5, эритроциты лизированы, имеют красный цвет, следовательно, штамм атоксигенен, гемолитичен и не имеет эпидемической значимости.