СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕПЕНИ ИНГИБИРУЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИ САХАРОВ НА ПРОЦЕСС АДГЕЗИИ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ Российский патент 2006 года по МПК C12Q1/04 C12R1/63 

Предлагаемое изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для характеристики патогенности холерных вибрионов.

Адгезия бактериальных клеток к клеткам тканей макроорганизма остается малоизученной. Микробные клетки как нормальной, так и патогенной микрофлоры прикрепляются к поверхности слизистой оболочки посредством довольно сложных механизмов. Путь к пониманию этих механизмов лежит через одновременное изучение органелл адгезии у бактерий и поверхностных структур тканей макроорганизма, по отношению к которым адгезия осуществляется.

Химическая природа холерных адгезинов, как и адгезинов других вибрионов, продолжает оставаться малоизученной. Есть немногочисленные сведения о том, что адгезины имеют белковую природу и обладают пектиновыми свойствами за счет углеводосвязывающего домена, что выражается в гемаглютинации.

Известен способ определения адгезивной способности холерных вибрионов (см. А.С. СССР №1306107, кл. С 12 N 1/00, С 12 Q 1/02, Б 24, 1990), заключающийся в том, что исследуемую культуру инкубируют с 0,5-1%-ной взвесью эритроцитов кролика, используемых в качестве субстрата и взятых в равных объемах, в течение 25-40 минут, затем посредством приготовления микроскопических препаратов определяют адгезивную способность по количеству вибрионов, прикрепившихся к субстрату.

Однако известный способ позволяет обнаруживать факт наличия адгезивной способности холерных вибрионов исследуемой культуры и не дает возможности определить наличие или отсутствие углеводосвязывающих доменов или пектиновых рецепторов, участвующих в процессе адгезии, а также оценить влияние разных веществ, а именно сахаров на процесс адгезии.

За прототип выбран способ оценки адгезивных свойств энтеропатогенных бактерий на эритроцитах (см. В.И.Бриллис, статья "Методика изучения адгезивного процесса микроорганизмов", журнал "Лабораторное дело", №4, Москва, Медицина, 1986 г.). На предметном стекле смешивают 1 каплю 1 млрд. взвеси холерных вибрионов и 1 каплю 5-10% взвеси эритроцитов, приготовленных на 0,1 М растворе фосфата Na, инкубируют при 37°С в течение 30 минут во влажной камере, после этого мазки фиксируют спиртом и окрашивают по Романовскому-Гимза, при этом изучение адгезии проводят под световым микроскопом с последующей оценкой среднего показателя адгезии (СПА), подсчет ведут на 100 эритроцитах, а адгезивность холерных вибрионов считают нулевой при СПА от 0 до 1; средней от 1,01 до 3; высокой - выше 3.

Недостатком прототипа является то, что при наличии факта адгезии невозможно изучить специфичность рецепторов самих холерных вибрионов, участвующих в адгезии, природу мишеней для адгезии на поверхности эритроцитов, а также влияние различных веществ, в частности сахаров, на процесс адгезии. Эти обстоятельства снижают биотехнологические возможности прототипа и сужают его применение для диагностики и лечения холеры.

Задача предлагаемого изобретения состояла в повышении биотехнологических возможностей способа в определении ингибирующей способности сахаров на адгезию холерных вибрионов.

Поставленная задача достигается тем, что в известном способе определения ингибирующей способности сахаров на адгезию холерных вибрионов, включающем инкубирование исследуемой культуры с эритроцитами, адгезию холерных вибрионов проводят в присутствии ингибитора, в качестве которого используют углеводы, последние взаимодействуют с пектиновыми рецепторами холерных вибрионов и тормозят их адгезивные свойства, для осуществления этого готовят 1% раствор углевода в 1 мл 1 млрд. взвеси холерных вибрионов, которые инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 30-40 минут, затем на стекло наносят в равных объемах эритроциты кролика и взвесь вибрионов с углеводами, инкубируют при температуре 37°С в течение 30-40 минут во влажной камере с последующим приготовлением микроскопических препаратов и определяют по шкале степень ингибиции сахарами адгезии исследуемой культуры. При этом по шкале показателей ингибиции адгезии (ПИА) определяют: слабый показатель ингибиции в пределах 0,36-0,9, средний показатель 0,176-0,35 и высокий 0,01-0,175.

Способ осуществляется следующим образом.

В качестве ингибиторов используют 1% растворы разных углеводов, например глюкозу, маннозу, фруктозу, галактозу или углеводсодержащие препараты.

Для проведения способа могут быть использованы эритроциты крови кролика, барана или человека.

Первоначально готовят 1 млрд. взвеси холерных вибрионов исследуемой культуры. Потом сухую навеску углевода в количестве 10 мг/мл (1% раствор) соединяют со взвесью холерных вибрионов и инкубируют при температуре 37°С в течение 30-40 минут.

Затем на предметное стекло наносят 1 каплю 5% эритроцитов (человека) и 1 каплю взвеси вибрионов с углеводами, инкубируют при температуре 37°С в течение 30-40 минут во влажной камере. После этого готовят мазок, фиксируют смесью Никифорова и окрашивают согласно методике В.И.Бриллиса.

Учет производят посредством микроскопа в два этапа:

1 этап - считают средний показатель адгезии (СПА) по методике В.И.Бриллиса. Подсчет ведут на 100 эритроцитов. Например, если на 100 эритроцитах прикрепилось 200 вибрионов, то СПА=(200:100)=2. Из таблицы 1 видно, что этот показатель соответствует средней адгезивности.

II этап - производят оценку среднего показателя ингибиции адгезии (ПИА) по шкале (см. таблицу 1).

Предлагаемая шкала основывается на проведенных примерах с разными ингибиторами, в качестве которых были взяты разные углеводы и по их взаимодействию с пектиновыми рецепторами холерных вибрионов различных штаммов определена следующая зависимость. Расчет вели из учета среднего количества вибрионов, прикрепившихся к одному эритроциту при использовании углевода. Например, если на 100 эритроцитов прикрепилось 25 вибрионов, то ПИА=25:100=0,25. ПИА в пределах 0,36-0,9 - слабый показатель ингибиции, средний показатель 0,176-0,35 и высокий 0,01-0,175.

В каждом опыте сравнивают два показателя СПА (без углевода) и ПИА (реакция с углеводами). Если, например, СПА=2, а ПИА=0,25, то делаем вывод, что углевод эффективно ингибировал адгезию (в пределах среднего показателя).

Таким образом, имеет место средний и высокий показатель ингибиции адгезии по сравнению с контролем адгезии по методике В.И.Бриллиса. Делаем вывод о наличии и специфичности пектиновых рецепторов, участвующих в адгезии, а также о влиянии определенного сахара на этот процесс.

Пример 1

Определяют ингибирующую способность углевода на адгезию холерных вибрионов у штамма V. Cholerae cholerae 569 В.

В качестве ингибитора берут галактозу в формах Д и β и глюкозу. Готовят 1% раствор галактозы и глюкозы в 1 мл 1 млрд. взвеси холерных вибрионов и инкубируют при температуре 37°С в течение 30-40 минут. Затем на предметное стекло наносят 1 каплю 5% эритроцитов барана и 1 каплю взвеси вибрионов с галактозой и глюкозой. Инкубируют при температуре 37°С в течение 30-40 минут во влажной камере, готовят мазок, фиксируют смесью Никифорова и окрашивают по Романовскому-Гимза. По истечении времени инкубации, под световым микроскопом считают показатель ингибиции адгезии - среднее количество вибрионов, прикрепившихся к одному эритроциту при использовании галактозы в формах Д и β и глюкозы. Параллельно ставят контроль адгезии (в полном соответствии с методикой В.И.Брилиса), затем сравнивают два показателя: средний показатель ингибиции адгезии (ПИА) и средний показатель адгезии (СПА) (см. таблицу 2).

Из таблицы 2 видно, что штамм высокоадгезивен, СПА=5. Галактоза в формах Д и Р снижает адгезию до 1,7 (ПИА), однако, согласно таблице 1 при СПА=1,01-2,9 штаммы считаются среднеадгезивными. Таким образом, делаем вывод, что галактозоспецифический рецептор (пектин) не доминирует при адгезии в отличие от глюкозоспецифического пектина, который активно участвует в адгезии, так как глюкоза подавляет адгезию до ПИА=0,1, что согласно таблице 1 соответствует среднему показателю ингибиции адгезии.

Пример 2

В качестве исследуемых культур используют штаммы V. Cholerae O 139 ("Бенгал"), а в качестве ингибиторов β-галактозу и N-ацетилманнозамин.

Последовательность действий способа такая как и в примере 1, а их результаты сведены в таблице 3.

Анализируя показатели таблицы 3, приходим к выводу, что штаммы "Бенгал" обладают средней адгезивностью, учитывая СПА, согласно таблице 1, галактозоспецифичный рецептор имеет место и активно участвует в адгезии, так как ПИА укладывается в диапазон высокого показателя ингибиции адгезии (0,01-0,175), слабее выражен глюкозоспецифичный пектиновый рецептор - ПИА соответствует среднему показателю ингибиции адгезии (0,176-0,35) и вообще отсутствует пектин, узнающий N-ацетилманнозамин, так как во всех шести штаммах ПИА более 1.

Пример 3

Отличается от примера 1 и 2 тем, что в качестве исследуемых культур используют штаммы V. Cholerae cholerae 569 В, V. Cholerae Eltor 1310, 5879, 18210, 3119, V. Cholerae О 139 16064, 16065, 16131, 16063, 16077. В качестве ингибитора адгезии используют глюкосалан - препарат для регидрационной терапии, содержащий глюкозу.

Результаты примера сведены в таблице 4.

Таким образом, по результатам исследования установлено, что глюкосалан эффективно ингибирует адгезию холерных вибрионов различных штаммов.

Использование предлагаемого изобретения позволяет за счет углеводсодержащих ингибиторов обнаруживать специфичность углеводосвязующего домена в холерных вибрионах исследуемой культуры к сахарам, что способствует уменьшению их адгезивной способности благодаря связыванию отдельных пектиновых рецепторов холерных вибрионов со специфическим для него углеводом.

При этом по шкале показателей ингибиции адгезии (ПИА), разработанной специалистами Ростовского-на-Дону научно-исследовательского противочумного института, возможно быстро установить степень ингибиции сахарами исследуемой культуры, что расширяет диагностические возможности в биотехнологии и может быть использовано в практическом применении при лечении холеры и ее профилактики при эпидемических вспышках, так как адгезия является начальным этапом патогенеза этого инфекционного заболевания.

Таблица 1Оценка среднего показателя адгезииоценка ингибиции адгезии углеводамиСПА=0-1 - не адгезивныПИА=0,36-0,9 слабый показатель ингибиции адгезииСПА=1,01-2,9 - адгезивны (средняя адгезивность)ПИА=0,176-0,35 средний показатель ингибиции адгезииСПА>3 - адгезия высокаяПИА=0,01-0,175 высокий показатель ингибиции адгезии

Таблица 2№ штаммаСПА(контроль)Показатель ингибиции адгезии (ПИА)Д-галактозаβ-галактозаглюкозаV. Cholerae cholerae 569 В5,0±0,21,5±0,031,7±0,050,1±0,02

Таблица 3№ штаммаСредний показатель адгезии (СПА)показатель ингибиции адгезии (ПИА)Д-галактозаГлюкозаN-ацетилманнозаминV. Cholerae O 139 160641,80,08±0,020,25±0,031,5±0,02160652,00,07±0,10,28±0,041,8±0,04161311,560,05±0,030,47±0,051,5±0,03160632,00,03±0,010,35±0,021,5±0,03160772,30,06±0,050,5±0,11,9±0,01

Таблица 4№ штаммаСПА(контроль)показатель ингибиции адгезии глюкосаланом (ПИА)V. Cholerae cholerae 569 В5,0±0,20,2±0,03V. Cholerae Eltor 13104,5±0,10,2±0,0358793,5±0,020,1 ±0,02182103±0,20,2±0,0231193,5±0,090,2 ±0,02160641,8±0,030,25±0,03160652±0,090,27±0,03161311,5±0,10,38±0,05160632±0,050,25±0,03160772,3±0,020,25±0,02

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для характеристики патогенности холерных вибрионов. Сущность изобретения заключается в том, что адгезию холерных вибрионов производят в присутствии ингибитора, в качестве которого используют углеводы, последние взаимодействуют с пектиновыми рецепторами холерных вибрионов и тормозят их адгезивные свойства. Для этого готовят 1% раствор углевода в 1 мл 1 млрд. взвеси холерных вибрионов, которые инкубируют при температуре 37°С в течение 30-40 минут во влажной камере с последующим приготовлением микроскопических препаратов. Степень игибирующей способности сахаров на процесс адгезии исследуемой культуры холерных вибрионов определяют по шкале показателей ингибиции адгезии (ПИА): слабый показатель ингибиции в пределах 0,36-0,9, средний показатель 0,176-0,35 и высокий 0,01-0,175. Использование способа позволяет повысить биотехнологические возможности определения. 4 табл.

Способ определения степени ингибирующей способности сахаров на процесс адгезии холерных вибрионов, включающий инкубацию исследуемой культуры совместно с эритроцитами, отличающийся тем, что адгезию холерных вибрионов производят в присутствии ингибитора, в качестве которого используют углеводы, последние взаимодействуют с пектиновыми рецепторами холерных вибрионов и тормозят их адгезивные свойства, для этого готовят 1%-ный раствор углевода в 1 мл 1 млрд. взвеси холерных вибрионов, которые инкубируют при температуре 37°С в течение 30-40 мин во влажной камере с последующим приготовлением микроскопических препаратов, в которых определяют степень ингибиции адгезии по шкале показателей ингибиции адгезии (ПИА), при этом за слабую степень ингибиции адгезии принимают ПИА в пределах 0,36-0,9, среднюю степень - в пределах 0,176-0,35 и высокую - 0,01-0,175.