СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ И РЕГИСТРАЦИИ МЕЧЕНЫХ БАКТЕРИОФАГОВ НА МОДЕЛИ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ Российский патент 2011 года по МПК C12N7/00 G01N33/534 

Предлагаемое изобретение относится к медицинской микробиологии, а именно к лабораторной диагностике холеры с применением радиобиологических методов исследования, которые могут быть использованы при фаговом мониторинге окружающей среды.

В настоящее время ограничено применение радиобиологических методов исследований в тест-системах, включающих трансдуцирующие, лизогенные свойства фагочастиц, что обеспечивается присутствием в их составе генов, способных экспрессироваться в фагочувствительных клетках холерных вибрионов и влиять на изменение биологических свойств возбудителей инфекционных болезней.

Предложен доступный способ получения и регистрации включения меченного изотопом фага в клетку и его перенос между штаммами холерных вибрионов (V.cholerae eltor). При этом внесенный в бактериальный вирус изотоп дает возможность проводить его детекцию по радиоактивности и, в свою очередь, облегчать диагностику холерных вибрионов.

Известен способ оценки индивидуальной химиочувствительности опухолей у больных (см. RU пат. №2068563, кл. G01N 33/48, 27.10.96 г.), включающий воздействие на контрольные и опытные культуры опухолевых клеток in vitro ³H-тимидином, экспозицию, проявление и окраску полученных препаратов с последующим светооптическим подсчетом индекса метки и вычислением показателей индивидуальной химиочувствительности, при этом воздействие проводят на первичные краткосрочные культуры опухолевых клеток в экспоненциальной фазе роста.

В известном способе, нашедшем свое использование в онкологии, так же как и в предложенном способе, исследования проводят с живой культурой, так как именно ³H-тимидин испускает β-излучения с низкой энергией (β-частиц - 0,5 мкм), не вызывающей повреждений ДНК.

Однако технология проведения оценки химиочувствительности у больных по индексу метки в опухолевых клетках in vitro ³H-тимидином имеет свою специфику и не может быть использована при исследованиях, связанных с патогенными микробами.

Известен способ тритиевой планиграфии (см. Ксенофонтов А.Л., Федорова Н.В., Бадун Г.А. и др. «Локализация матриксного белка М 1 вируса гриппа в вибрионе». Молекулярная биология, 1999 г., том. 33, №5, стр.881-886), заключающийся в том, что суспензии вируса гриппа А и В выращивают в 10-дневных куриных эмбрионах, после проводят бомбардировку упомянутых суспензий потоком атомов, тритийсодержащих тимидин, осуществляя мечение доступных участков макромолекул, причем метятся не только поверхностные гликопротеины, но и матриксный белок М 1.

Недостатком известного способа является то, что выращивать бактериофаги холерных вибрионов по типу вирусов гриппа в куриных эмбрионах невозможно, т.к. индикаторные штаммы холерных вибрионов не размножаются в куриных зародышах.

При этом бомбардировку препаратов атомным тритием проводят на установке, которой не располагают микробиологические лаборатории, проводящие работу с микроорганизмами II группы патогенности.

Таким образом, известный способ неэффективен для получения холерного бактериофага, меченного ³H тимидином.

Наиболее близким по технической сущности является способ воздействия бактериофага Ф149 на классические и эль-тор вибрионы (см. Maiti М. «Mode of action of bacteriophage Ф149 on cholera and El Tor Vibrio» Canadian Journal of Microbiology, 1978, v.24, №12, p.1583-1589), заключающегося в том, что ДНК меченого ³²Р фага инъецировали в клетку, причем лизированные клетки содержали радиоактивность в нерастворимой порции НСlO₄.

Недостатком способа является отсутствие размножения меченой ДНК фага в штаммах холерных вибрионов биовара эльтор, в связи с этим применение фага ограничивается холерным штаммом классического биовара, так как только в нем сохраняется репродукция меченого фага.

При этом изотоп ³²Р испускает излучение высокой энергии и большой длиной пробега (2600 мкм), что приводит к генетическим повреждениям и соответственно при включении в ДНК возникает ее мутация, что было обнаружено на прокариотах и сопровождалось гибелью фагов.

Таким образом, известный способ неэффективен для использования метки, способной обнаруживать фаг в клетке возбудителя холеры.

Технической задачей предлагаемого изобретения является повышение эффективности обнаружения и регистрации холерного фага путем мечения фагочастиц ³H-тимидином и переноса фага в клетки холерного вибриона.

Поставленная задача достигается тем, что в известном способе получения и регистрации меченых бактериофагов на модели холерных вибрионов получают штамм-донор, продуцирующий меченный изотопом бактериофаг, который предварительно выделяют из лизогенного штамма V.cholerae eltor в концентрации n 10⁸ БОЕ/мл, затем к нему добавляют 5 мкк/мл изотопа ³H-тимидина и сутки выдерживают при 37°С, получая меченый холерный фаг, последний вносят в количестве 1 мл в пробирку с индикаторным штаммом-реципиентом для его лизогенизации в соотношении 1:1, инкубируют при 37°С в течение суток, причем из полученной смеси 0,1 мл высевают на агаровую пластину, выращивают при 37°С в течение 20-24 часов и выделяют штамм-донор, при этом проводят регистрацию на радиоактивность каждой пробы, за положительный результат принимают радиоактивность меченых бактериофагов в диапазоне 475÷1269 имп./мин, штаммов-доноров в диапазоне 745÷990 имп./мин, а штаммов-реципиентов в диапазоне 78÷103 имп/мин.

Способ осуществляют на модели штаммов Vibrio cholerae eltor.

Пример 1. Получение меченных изотопом холерных бактериофагов.

Первоначально на первом этапе выделяют холерный бактериофаг 10345 из лизогенного штамма Vibrio cholerae eltor P - 10345 (депонирован в ГКПБ институте «Микроб» под номером КМ-60). Для этого одну петлю суточной агаровой культуры КМ-60 засевают в 4 мл бульона Мартена и сутки выращивают при температуре 37°С, затем проводят инактивацию бактерий хлороформом (1:10) с последующим получением надосадочной жидкости, содержащей бактериофаг в титре 10² БОЕ/мл. Для повышения титра проводят не менее четырех пассажей с упомянутой жидкостью в присутствии штамма V.eltor 208-27 (KM 185), депонированный в ГКПБ институт «Микроб», и получают фаг 10345 в концентрации n 10⁸ БОЕ/мл.

После этого вторым этапом к 1 мл полученного бактериофага 10345 добавляют радиоактивное соединение ³Н-тимидин (производства фирмы «Изотоп», Россия) в концентрации 5 мкк/мл, сутки выдерживают в термостате при 37°С, получая таким образом меченый холерный фаг 10345 ³H.

При этом выбор концентрации (5 мкк/мл) необходим и оптимален, так как доза от 0,5-2 мкк/мл достаточна для метки фага в случае однократной лизогенизации. Для получения штамма-донора вышеуказанной концентрации недостаточно, как min необходимо 5 мкк/мл для переноса фага в штамм-реципиент для проведения диагностического теста и измерения большей интенсивности включения изотопа ввиду того, что при низких дозах ³H-тимидина количество импульсов маленькое. В повышенной, например, дозе 7,5 мкк/мл происходит изменение рецепторов клеточной стенки, которая приводит к фагорезистентности к диагностическому холерному фагу эльтор, что исключает применение возрастающих концентраций изотопа для диагностики.

Третий этап характеризуется получением штамма-донора, продуцирующего меченый фаг, путем проведения лизогенизации фагочувствительного штамма V.cholerae eltor. Для этого в качестве индикаторного штамма-реципиента используют КМ-185, в пробирку которого вносят 1 мл фага, меченного ³H-тимидином (в соотношении 1:1), и инкубируют при 37°С в течение суток для лизогенизации.

Из этой смеси 0,1 мг высевают на агаровую пластинку и выращивают при 37°С в течение 20-24 часов. Таким образом, получают продуцент меченого фага или штамм-донор, обозначенный как 1-я проба (см. таблицу 1). Штамм-донор, меченный фагом ³H-тимидином, используют для фаговых мониторингов объектов окружающей среды, и в качестве тест-системы, сохраняя материал в холодильнике при t +4°C в течение года, и применяют в качестве источника меченых фагов.

В оставшуюся часть пробы 1 для подсчета ее радиоактивности добавляют 1 мл 5% трихлоруксусной кислоты (ТХУ) и оставляют на 1 сутки при температуре 37°С. Затем эту смесь центрифугируют 20 мин при 2000 об/мин, удаляют надосадочную жидкость, к осадку добавляют 1 мл физиологического раствора (физ. раствор). После этого 1-ю пробу фильтруют на фильтровальной установке (NSI San Francisco California) через фильтры (Whatman GF/c).

Пробу промывают трижды физ. раствором, затем 70° спиртом. После чего фильтры помещают во флаконы со сцинтилляционной жидкостью (ЖС-8п) и просчитывают радиоактивность в счетчике Mark II (США).

Кроме приведенного выше способа на модели холерного вибриона заявителем были выявлены условия мечения холерного фага 2044 и 3119 на фагочувствительном штамме V.cholerae eltor P-13169 (KM-199, штамм депонирован в ГКПБ института «Микроб») (см. таблицу 1).

Таким образом, из таблицы 1, 2 наблюдаем интенсивность включения радиоактивной метки на моделях штаммов V.cholerae eltor, лизогенизированных меченным ³Н-тимидином холерным фагом (2044, 3119, 10345). Регистрация импульсов показывает, что первичный меченый фаг сопровождается высокой радиоактивностью, а уже при включении в клетку их радиоактивность снижается, что регистрируется по числу импульсов, например, при заражении штамма 13169 (KM-199) фагом 2044 меченного ³Н-тимидином регистрируют в лизогенной клетке 990 имп./мин, а первичная доза импульса в фаге составила 1269 имп./мин.

Следовательно: на моделях нескольких штаммов нашло подтверждение, что заявителем были получены меченные изотопом фаги, лизогенизированные ими: штаммы-реципиенты и штаммы-доноры, продуцирующие меченные ³H-тимидином фаги.

Пример 2. Перенос меченого холерного фага в клетку штамма-реципиента

Штамм-донор 208 - 27/10345 ³H (Д) (штамм V.eltor 208-27 (KM-185) меченый ³H-тимидином с фагом 10345 ³H) (Д) засевают в пробирку с 4 мл бульона, через сутки выращивания при 37°С инактивируют бактерии хлороформом (1:10) и после центрифугирования отбирают надосадочную жидкость, содержащую фаг 10345 ³H (Д). В пробирку с 1 мл суточной бульонной культуры 208-27 (KM-185) (нелизогенный фагочувствительный штамм) вносят 1 мл фага 10345 ³H (Д) и выращивают 20-24 часа при 37°С).

Полученную пробу 2 далее исследуют на радиоактивность после добавления 5% ТХУ.

Результаты измерений показали 760 имп./мин (1 проба, таблица 1) и 78 имп/мин (2 проба, табл.2). Таким образом, результаты позволяют констатировать присутствие меченого фага в клетках холерного вибриона. При этом его активность регистрируют и после выделения из лизогенизированной культуры, и переноса в нелизогенный фагочувствительный штамм-реципиент. Последний также под воздействием меченого фага переносит определенные признаки донора, т.к. фаг внедряется в клетку холерного вибриона с переносом лизогении, причем в следующем штамме (см. таблица 2, проба 2) регистрируют число импульсов метки уже слабее предыдущей (78 имп/мин), и так происходит последовательно со всеми следующими штаммами, включающими холерный фаг до исчезновения радиоактивности. По радиоактивному фагу в исследуемой пробе определяют есть или нет в пробе холерные вибрионы при мониторинге сточных вод на вибриофлору.

Пример 3. Регистрация переноса и включения меченого холерного фага в клетку по фагоустойчивости лизогенизированной фагом культуры вибрионов

Штамм 208 - 27/10345 ³H засевают в пробирку с бульоном Мартена и выращивают 4 часа при 37°С. Затем 0,3 мл культуры вносят в 4 мл 0,7% агара (растопленного и охлажденного до 45-47°С) и выливают вторым слоем на поверхность агаровой пластинки 1,5% агара Мартена (рН 7,6). После застывания агара наносят фаг 10345 ³H (Д) в виде «дорожки» на газон засеянной культуры. Посев инкубируют в термостате при 37°С 20-24 часа и учитывают результат.

Отсутствие зоны лизиса культуры в месте нанесения меченого фага свидетельствует об иммунитете холерного вибриона к переносимому фагу.

Приобретение иммунитета обработанного фагом штамма и продукция бактериофага является доказательством способности меченого фага передавать новые свойства штамму холерного вибриона. Механизм этого явления связан с внесением новой информации в бактериальную клетку.

Таким образом, из примеров 1, 2, 3 видно, что наличие радиоактивной метки в 1, 2, и 3 пробах лизогенизированных культур холерных вибрионов свидетельствует об участии в этом процессе меченого изотопом фага, который обнаруживается по включению ³H-тимидина в геном холерного фага в диапазоне 475÷1269 (проба 1) и 92÷215 (проба 3) и при переносе в штамм-донора и штамм-реципиента. За положительный результат принимают радиоактивность штамма-донора (пробы 1) в диапазоне от 745÷990 имп./мин и штамма-реципиента (пробы 2) от 78÷103 имп./мин.

При этом меченый фаг пригоден для передачи генетической информации штаммам холерных вибрионов, отобранных в качестве реципиентов.

Штаммы-доноры холерного вибриона являются продуцентами меченых фагов, которые используют в качестве источника фагов для передачи метки при проведении фаговых мониторингов окружающей среды от (6-8 манипуляций) до тех пор, пока счетчик будет регистрировать радиоактивность.

Пример 4. Использование меченого бактериофага при мониторинге речной воды (р. Дон) на вибриофлору

В исследуемую пробу с 4 мл речной воды (рН 7,6-7,8) вносят 5 мкк/мл ³H-тимидина. Через 1 сутки контакта вносят 1,0 мл фагочувствительной культуры V.eltor Р-13169 (KM-199) в концентрации n 10⁸ м.к./мл и выращивают при 37°С 20-24 часа.

После выращивания при 37°С из пробы высевают 0,1 мл смеси на агаровую пластинку в чашке Петри, оставляют в термостате на 20-24 часа. Далее выполняют приемы, описанные в примере 1. В оставшуюся часть пробы добавляют 1 мл 5% ТХУ и спустя сутки пробу исследуют на радиоактивность. Интенсивность включения изотопа составляет 745 имп/мин.

Для подтверждения присутствия холерного фага в пробе воды высевают фагочувствительный штамм V.cholerae eltor KM - 199 двухслойным методом в чашку Петри и на газон наносят в виде «дорожки» каплю инактивированной хлороформом 1 суточной бульонной культуры, полученной из выросшей смеси агаровой культуры KM-199 с меченым фагом, посев помещают в термостат при 37°С и выращивают 20-24 часа. В месте нанесения пробы на газон штамма отмечают зону лизиса меченого бактериофага. Затем меченым фагом обрабатывают штамм-реципиент V.eltor KM-199 в бульоне в соотношении 1:1 и после суточного контакта определяют интенсивность включения радиоактивной метки, добавив 5% ТХУ - 1 мл. Она составила 102 имп/мин. Доказательством специфичности взаимодействия обнаруженного в пробе воды фага является радиоактивность лизогенизированной культуры. Эффективность использования свежевыделенного меченого холерного фага зависит от его серологического типа и имеет значение в оценке эпидемической значимости циркулирующих в реке Дон холерных вибрионов. Так обнаружение фагов II серотипа характерно для контаминации окружающей среды эпидемическими штаммами V.cholerae eltor (ctx⁺), а фагов XII серотипа - для неэпидемических (ctx^-).

Таким образом, проба воды из реки Дон содержит холерный фаг, что подтверждает присутствие холерных вибрионов в речной воде.

Использование предлагаемого изобретения позволяет за счет получения меченого бактериофага создавать штамм-донор V.cholerae eltor, продуцирующий меченный изотопом фаг, осуществлять перенос признака лизогении меченным ³H-тимидином фагом в последующие штаммы-реципиенты, выполняя роль биомаркера и свидетельствуя о передаче генетической информации, регистрируемой по радиоактивности лизогенизированного штамма, о локализации фага в клетке, а также о связи ДНК с меткой ³H-тимидина.

Эти обстоятельства дают целый ряд преимуществ предложенному способу и подтверждают его эффективность в применении:

- в генетических исследованиях, так как осуществима количественная регистрация изотопов в клетке, поступивших с меченым холерным фагом, где показана эффективность проведения лизогенизации;

- как диагностический тест с применением биомаркера (изотоп+фаг) - меченного ³H-тимидином холерного фага для детекции фага в пробах сточной воды (воды рек, водоемов) при мониторинге внешней среды за контаминацией холерными вибрионами, причем присутствие в воде холерного фага свидетельствует о биологическом загрязнении водоема и необходимости усиления эпиднадзора за холерой;

- характеризуется специфичностью, не требует большого количества индикаторных штаммов (реципиентов) для размножения фага, не требует предварительной обработки проб от примеси гетерологичных фагов, доступен для исследования неограниченного числа проб одномоментно, т.е. экономичен для применения в медицинской практике, производителен и повышает качество исследований воды.

Кроме того, дальнейшее развитие таких исследований на основе способа дают возможность внести новый вклад в познание новых форм изменчивости холерного вибриона и открыть новые подходы к диагностике, лечению и профилактике холеры.

Таблица 2 Этап исследования Штамм-реципиент для лизогенизации меченым «донорским» фагом Название «донорского» фага, выделенного из штамма-донора Обозначение штамма V.eltor, лизогенизированного меченым «донорским» фагом Число имп/мин штамма-реципиента, лизогенизированного «донорским» меченым фагом Проба 2 1 2 3 4 5 Лизогенизация штамма-реципиента V. cholerae eltor меченным ³H-тимидином холерным фагом, выделенным из штамма-донора (проба 2)         208-27 10345-³H(Д) 208-27-10345-^-3H(Д) 78                         Р-13169 2044-³H(Д) 13169-2044-^-3H(Д) 90                         Р-13169 3119-³H(Д) 13169-3119-^-3H(Д) 103        

Таблица 3 Этап исследования Штамм-донор, продуцент меченого фага Название продуцируемого и «донорского» меченого фага Число имп/мин «донорского» меченого фага из лизогенизирован ного штамма донора Продукция меченого фага Иммунитет к фагу лизогенизированного штамма донора 1 2 3 4 5 6 Выделение меченного ³H-тимидином фага из лизогенизированного штамма-донора V.cholerae eltor (проба 3) 208-27/10345- ³H 10345-³H(Д) 92 + + 13169/2044-³H 2044-³H(Д) 215 + +                     13169/3119-³H 3119-³Н(Д) 107 + +          

Сущность изобретения заключается в том, что получают штамм-донор, продуцирующий меченый изотопом бактериофаг, который предварительно выделяют из лизогенного штамма V.cholerae eltor в 1 концентрации n·10⁸ БОЕ/мл, затем к нему добавляют 5 мкк/мл изотопа ³H-тимидина, и сутки выдерживают в термостате при 37°С, получая меченый холерный фаг. Последний вносят в количестве 1 мл в пробирку с индикаторным штаммом-реципиентом в соотношении 1:1 для его лизогенизации, инкубируют при 37°С в течение суток, из полученной смеси 0,1 мл высевают на агаровую пластину, выращивают при 37°С в течение 20-24 часов и выделяют штамм-донор. Оставшуюся часть смеси используют для регистрации радиоактивности бактериофага и штамма-реципиента. За положительный результат принимают радиоактивность меченых бактериофагов в диапазоне 475-1269 имп/мин, а штаммов-реципиентов в диапазоне 78-103 имп./мин. Изобретение позволяет повысить эффективность обнаружения и регистрации холерного фага в клетке холерного вибриона, меченого ³H-тимидином. 3 табл.

Способ получения и регистрации меченых бактериофагов на модели холерных вибрионов, включающий использование радиобиологических методов исследования путем мечения холерного фага изотопом, отличающийся тем, что на первом этапе выделяют холерный бактериофаг из лизогенного штамма V. cholerae eltor в концентрации n·10⁸ БОЕ/мл, на втором этапе получают меченый холерный фаг, для этого к 1 мл бактериофага добавляют ³Н-тимидина в концентрации 5 мкк/мл, сутки выдерживают в термостате при 37°С, на третьем этапе получают штамм-донор, продуцирующий меченый фаг, для этого последний вносят в количестве 1 мл в пробирку с индикаторным штаммом-реципиентом для его лизогенизации в соотношении 1:1, инкубируют при 37°С в течение суток, из полученной смеси 0,1 мл высевают на агаровую пластину, выращивают при 37°С в течение 20-24 ч и выделяют штамм-донор, оставшуюся часть смеси используют для регистрации радиоактивности бактериофага и штамма-реципиента, за положительный результат принимают радиоактивность меченых бактериофагов в диапазоне 475-1269 имп/мин, а штаммов-реципиентов в диапазоне 78-103 имп/мин.