СПОСОБ ОЦЕНКИ МЕСТНОГО ГУМОРАЛЬНОГО ПРОТИВОХОЛЕРНОГО ИММУНИТЕТА IN VITRO НА МОДЕЛИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ Российский патент 2014 года по МПК G09B23/28 G01N33/531 A61K38/08 A61P31/04 

Изобретение относится к медицине, в частности к вопросу изучения антиадгезивной активности противохолерных иммуноглобулинов и усиления ее для совершенствования специфической профилактики холеры.

Холера является антропонозным заболеванием, поэтому разработка моделей инфекции на животных всегда встречала серьезные трудности. До настоящего времени экспериментаторы предпринимают многочисленные попытки отработать модель инфекции на мышах. Существуют модели генерализованной формы холеры у мышей, опечатанные мыши. Учитывая, что заболевание холерой развивается и протекает в тонком кишечнике, были разработаны несколько экспериментальных моделей, позволяющих получить у животных патогенетическую картину заболевания холерой, сходную с таковой у человека: модель перевязанной петли тонкого кишечника взрослого кролика, кроликов-сосунков.

Однако в настоящее время отсутствуют способы и модели, позволяющие оценить действие различных препаратов, например иммуномодуляторов, на формирование местного противохолерного иммунитета, в частности на усиление антителообразования и антиадгезивной активности противохолерных иммуноглобулинов (Ig). Разработка таких экспериментальных способов и моделей очень актуальна, так как первым препятствием на пути многих инфекций, в том числе и холеры, являются факторы защиты, действующие на поверхности слизистых (клетки эпителия, различные бактерицидные вещества, секреторные IgA и др.) и предотвращающие адгезию патогенов [1, 2]. При этом показано преобладающее значение антибактериального компонента, препятствующего прикреплению холерных вибрионов к слизистой кишечника на первых этапах инфицирования организма [3]. Одним из основных показателей антибактериального иммунитета является антиадгезивная активность противохолерных Ig, наличие которых, наряду с антитоксическими антителами, свидетельствует об адекватности формирования местного гуморального иммунитета [4, 5].

За прототип выбран способ оценки эффективности применения иммуномодулятора имунофана при экспериментальной холере (см. патент RU №2481791, кл. А61В 10/00, A61K 38/08, A61P 43/00, G09B 23/28), заключающийся в том, что до заражения животных в изолированную петлю тонкого кишечника вирулентным штаммом им вводят иммуномодулятор имунофан в дозе 0,2 мкг, разведенный в 0,3 мл новокаина, в количестве 10 инъекций. Оценку эффективности применения имунофана проводят по наличию в опытных перевязанных петлях тонкого кишечника энтеропатогенного эффекта, выраженность которого оценивают в крестах, и наличию холерогенного эффекта, который рассчитывают по формуле K=Vж/Нп, где K - коэффициент растяжения петли, Vж - объем жидкости, Нп - длина петли, если в опытных петлях энтеропатогенный эффект отсутствует и K<1,0, считают использование имунофана эффективным.

Однако задача известного способа заключалась в проведении оценки действия иммуномодуляторов на развитие и выраженность патогенетической картины экспериментальной холеры и не дает возможности изучения in vitro формирования противохолерного иммунитета, в частности действия различных препаратов, в том числе и иммуномодуляторов, на антиадгезивную активность общего пула противохолерных Ig из тонкокишечных промывных жидкостей белых мышей.

Цель предлагаемого изобретения состояла в разработке способа, позволяющего оценить in vitro специфический местный гуморальный иммунитет при экспериментальной холере, а также усилить антиадгезивную активность общего пула противохолерных Ig из тонкокишечных промывных жидкостей белых мышей в процессе формирования противохолерного иммунитета.

Поставленная цель достигается тем, что в известном способе оценки местного гуморального противохолерного иммунитета в эксперименте белых мышей иммунизируют 5×10⁷ микробными клетками Vibrio cholerae 5879, через 10 дней выделяют общий пул противохолерных Ig из тонкокишечных промывных жидкостей мышей, дополнительно получают первичную культуру энтероцитов тонкой кишки от интактных мышей, затем противохолерные Ig в двукратном разведении наносят в объеме 3 мл на монослой энтероцитов, сформированных в лунках культуральных панелей, затем в последние наносят живые холерные вибрионы штамма Vibrio cholerae 5879, 40 м.к. на 1 энтероцит и инкубируют в течение 3 часов, после панели трижды отмывают, фиксируют этанолом в течение 20 мин и окрашивают по Романовскому - Гимза, оценку местного гуморального противохолерного иммунитета проводят под микроскопом по количеству вибрионов, окрашенных в темно-синий цвет и прикрепившихся к одному энтероциту.

При этом общий пул противохолерных Ig получают из промывных жидкостей тонкого кишечника, для этого на последний накладывают две лигатуры на расстоянии 5 см друг от друга и вводят в изолированный участок 5 мл физиологического раствора, массируют и шприцем берут жидкость, которую осаждают 50% сульфатом аммония, а сформировавшийся в течение ночи при 4°C осадок центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 мин.

Кроме того, первичную культуру энтероцитов тонкой кишки получают от интактных белых мышей, для этого в просвет промытой тонкой кишки животных вводят шприцем 5 мл 0,2% этилендиаминтетрауксусной кислоты, массируют 30 мин и отсасывают содержимое пипеткой, полученные клетки трижды отмывают физиологическим раствором, суспендируют в питательной среде с 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 10 мМ HEPES, 5×10⁵ М 2-меркаптоэтанола, 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина до концентрации 150000 кл/мл и высевают в лунки 6-луночных культуральных панелей Costar, после панели инкубируют в CO₂-инкубаторе в течение суток для формирования разреженного монослоя, затем клетки трижды отмывают свежими порциями среды без сыворотки.

Причем для проведения иммунизации животных штаммом Vibrio cholerae 5879 последний выращивают при 37°C в течение 24 ч на агаре Мартена (рН 7,6) с последующей инактивацией с помощью кипячения на водяной бане в течение 30 мин и проверки на специфическую стерильность.

Способ осуществляют в два этапа:

I этап - выделяют общий пул противохолерных Ig из тонкокишечных промывных жидкостей белых мышей;

II этап - оценивают антиадгезивную активность полученных по I этапу противохолерных Ig на монослое энтероцитов.

Для проведения I этапа две группы опытных мышей по 12 штук в каждой перорально иммунизируют убитыми микробными клетками (м.к.) Vibrio cholerae 5879 (5×10⁷ м.к.). Штамм 5879 V. cholerae O1 серовара Инаба получают из коллекции живых культур РостНИПЧИ. Последний предварительно выращивают при 37°C в течение 24 ч на агаре Мартена (рН 7,6). Инактивацию бактериальной культуры осуществляют кипячением на водяной бане в течение 30 мин. После проверки на специфическую стерильность суспензию бактериальных клеток используют для иммунизации животных.

Затем второй опытной группе животных внутримышечно, ежедневно, в течение 10 дней, вводят по 0,2 мл 0,0005% раствора имунофана. Первая опытная группа иммунизированных мышей иммуномодулятор не получает.

После этого выделяют общий пул противохолерных Ig из промывных жидкостей тонкого кишечника убитых мышей каждой из опытных групп. Для этого у белых мышей на тонкий кишечник накладывают 2 лигатуры на расстоянии 5 см друг от друга, вводят в изолированный участок тонкого кишечника 5 мл физиологического раствора, массируют несколько минут и берут содержимое с помощью шприца. Промывные жидкости осаждают 50% сульфатом аммония. Сформировавшийся в течение ночи при 4°C осадок отделяют центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 мин. Осажденные белки диализуют против дистиллированной воды (с трехкратной сменой дилюента), разводят до исходного объема и стерилизуют фильтрованием через мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм Schleicher&Schuell.

II этап заключается: а) в выделении первичной культуры энтероцитов; б) в оценке антиадгезивной активности противохолерных Ig на монослое энтероцитов

а) первичную культуру энтероцитов тонкой кишки для оценки адгезивной активности живых холерных вибрионов получают от 10 интактных белых мышей. Для этого в просвет промытой тонкой кишки животных вводят шприцем 5 мл 0,2% этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) (Германия), осторожно массируют в течение 30 мин и отсасывают содержимое пипеткой. Клетки трижды отмывают физиологическим раствором, суспендируют в питательной среде ДМЕМ (Германия) с 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина (Россия), 10 мМ HEPES (Швейцария), 5×10⁵ М 2-меркаптоэтанола (США) 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина до концентрации 150000 кл/мл и высевают в лунки 6-луночных культуральных панелей Costar (Нидерланды). Панели инкубируют в CO₂-инкубаторе в течение суток для формирования разреженного монослоя, после чего клетки трижды отмывают свежими порциями среды без сыворотки.

б) для оценки антиадгезивной активности противохолерных Ig последние в двукратном разведении в объеме 3 мл наносят на панели с монослоем энтероцитов. При этом в одни лунки вносят противохолерные Ig, полученные от животных опытной группы, где была проведена только иммунизация штаммом V. cholerae 5879, а в другие - общий пул Ig выделенных от группы животных иммунизированных и получавших имунофан. В контрольные лунки к энтероцитам добавляют физиологический раствор. Затем во все лунки вносят живые холерные вибрионы штамма Vibrio cholerae 5879 (на 1 энтероцит - 40 м.к.) и инкубируют 3 часа в CO₂-инкубаторе. Панели трижды отмывают свежими порциями физиологического раствора, фиксируют этанолом в течение 20 мин и окрашивают по Романовскому - Гимза. Для этого 3,8 г сухой краски Романовского растворяют в 250 мл чистого этилового спирта. В течение 4 суток раствор взбалтывают, затем добавляют 250 мл глицерина и вновь взбалтывают в течение 4 суток. Панели окрашивают рабочим раствором краски (1 мл краски : 10 мл дистиллированной воды) в течение 20 мин. После экспозиции лунки промывают трижды дистиллированной водой, высушивают, подсчитывают под микроскопом (окуляр 10, объектив 90) количество окрашенных в темно-синий цвет, прикрепившихся к 200 энтероцитам вибрионов и определяют их среднее значение.

О наличии выраженности антиадгезивной активности судят по уменьшению числа прикрепившихся к одному энтероциту вибрионов не менее чем в 2 раза в сравнении с контролем.

При иммунизации количество прикрепившихся вибрионов уменьшается по сравнению с контролем в 2 раза на 14 сутки постиммунизационного периода, а добавление иммунотерапии сокращает этот срок до 7 суток, что свидетельствует об усилении антиадгезивной активности противохолерных антител под влиянием иммуномодулятора имунофана.

Таким образом, данный способ позволяет определить антиадгезивную активность общего пула противохолерных Ig, полученных из тонкокишечных промывных жидкостей иммунизированных мышей в разные сроки после иммунизации, а также оценить влияние иммуномодуляторов, в частности имунофана, на увеличение способности данных антител препятствовать адгезии холерных вибрионов к энтероцитам in vitro.

Пример 1. Оценка антиадгезивной активности общего пула противохолерных Ig, полученных из тонкокишечных промывных жидкостей иммунизированных мышей.

Изучена антиадгезивная активность по технологии предложенного способа (см. «Способ осуществляется…») противохолерных Ig, выделенных из тонкого кишечника иммунизированных м.к. штамма V. cholerae 5879 мышей. В разные сроки после иммунизации (см. таблицу 1) выявлено снижение среднего количества прикрепившихся к одному энтероциту вибрионов на 5 сутки, что свидетельствовало о начале синтеза специфических антител. На 14 сутки антиадгезивная активность этих Ig достоверно увеличилась по сравнению с началом иммунизации и продолжала увеличиваться до конца наблюдаемого периода.

Таблица 1 Сутки после иммунизации Количество вибрионов, прикрепившихся к одному энтероциту Контроль 25,6±0,4 3 24,6±0,4 5 18,9±0,3 7 15,4±0,3 14 12,6±0,3 21 11,4±0,2 28 10,3±0,2

Таким образом, из примера видно, что уже на 14 сутки после иммунизации среднее число прикрепившихся к энтероцитам вибрионов уменьшилось по сравнению с контролем в 2 раза, что свидетельствует о наличии достаточного количества специфических противохолерных антител. Предложенный способ дает возможность оценить их антиадгезивную активность и позволяет судить об адекватности формирования местного гуморального противохолерного иммунитета.

Пример 2. Изучение влияния иммуномодулятора имунофана на антиадгезивную активность общего пула противохолерных Ig, полученных из тонкокишечных промывных жидкостей иммунизированных мышей в процессе формирования местного противохолерного иммунитета.

Изучение влияния иммуномодулятора имунофана на способность противохолерных Ig препятствовать адгезии вибрионов в разные сроки постиммунизационного периода показало (см. таблицу 2), что антиадгезивная активность антител, выделенных из смывов слизистой тонкого кишечника иммунизированных и получавших иммуномодулятор мышей, проявлялась в большей степени и более ранние сроки, чем у иммунных животных. На 7 сутки среднее число прикрепившихся к одному энтероциту вибрионов в пробах, содержащих промывные жидкости, полученные от животных после иммунизации и иммунокоррекции, было достоверно ниже, чем в лунках с Ig, выделенными от животных иммунизированных и не получавших имунофан. Такая тенденция сохранялась во все сроки наблюдения (до 28 суток). Уменьшение в 2 раза среднего числа прикрепившихся к энтероцитам вибрионов в сравнении с контролем уже на 7 сутки постиммунизационного периода свидетельствовало об увеличении антиадгезивной активности противохолерных Ig под влиянием иммуномодулятора.

Таблица 2 Сутки после иммунизации Количество вибрионов, прикрепившихся к одному энтероциту Контроль 25,6±0,4 3 23,8±0,4 5 13,3±0,3 7 10,5±0,2 14 8,6±0,2 21 7,8±0,2 28 6,3±0,2

Таким образом, с помощью предложенного способа на модели in vitro выявлено стимулирующее действие иммунодулятора имунофана на продукцию противохолерных Ig и на увеличение их антиадгезивной активности. Антиадгезивная активность иммуноглобулинов препятствует адгезии холерных вибрионов к энтероцитам, обеспечивая наиболее существенный уровень защиты слизистой оболочки тонкого кишечника.

Использование предлагаемого изобретения позволяет за счет возможности изучения антиадгезивной активности общего пула противохолерных Ig из тонкокишечных промывных жидкостей иммунизированных мышей оценивать in vitro специфический местный гуморальный иммунитет при экспериментальной холере.

Кроме того, данный способ позволяет изучить увеличение синтеза противохолерных антител и усиление их антиадгезивной активности под влиянием иммуномодуляторов непосредственно в кишечнике, где происходит взаимодействие макроорганизма с возбудителем холеры.

Таким образом, предложенный способ дает возможность оценить адекватность формирования местного противохолерного иммунитета по антиадгезивной активности специфических антител, а также влияние различных препаратов на иммунный ответ к возбудителю холеры, что открывает новые подходы к совершенствованию вакцинопрофилактики этого заболевания.

Источники информации

1. Костюкова Н.Н. Начальный этап инфекционного процесса - колонизация и пути ее предотвращения // Журн. микробиол., эпидемиол., иммунобиол. - 1989. - №9. - С.103-110.

2. Williamson E., Westrich G.M., Viney I.L. Modulating dendritic cells to optimize mucosal immunization protocols // J. Immunol. - 1999. - Vol.163, №7. - P.3668-3675.

3. Yamamoto Т., Fibert M.J., Bradley S.R. et al. Adherence to human small intestines of capsulated Vibrio cholerae 0139 // FEMS Microbiol. Lett. - 1994. - Vol.119, №1-2. - P.229-235.

4. Челядинова А.В. Изучение биологических свойств холерных вибрионов 0139 серогруппы: Автореф. дис… канд. мед. наук. - 2000. - 18 с.

5. Jerborn M., Nordstrom I., Kilander A. et al. Local and systemic immune responses to rectal administration of recombinant cholera toxin В subunit in humans // Infect. Immun. - 2001. - Vol.69, №6. - P.4125-4128.

Изобретение относится к медицине, в частности к вопросу изучения антиадгезивной активности противохолерных иммуноглобулинов и усиления ее для совершенствования специфической профилактики холеры. Для оценки местного гуморального противохолерного белых мышей иммунизируют 5×10⁷ микробными клетками Vibrio cholerae 5879, через 10 дней выделяют общий пул противохолерных Ig из тонкокишечных промывных жидкостей. Дополнительно получают первичную культуру энтероцитов тонкой кишки от интактных мышей. Затем противохолерные Ig в двукратном разведении наносят в объеме 3 мл на монослой энтероцитов, сформированных в лунках культуральных панелей. В последние наносят живые холерные вибрионы штамма Vibrio cholerae 5879, 40 м.к. на 1 энтероцит и инкубируют в течение 3 часов. После панели трижды отмывают, фиксируют этанолом в течение 20 минут и окрашивают по Романовскому - Гимза. Оценку местного гуморального противохолерного иммунитета проводят под микроскопом по количеству вибрионов, окрашенных в темно-синий цвет и прикрепившихся к одному энтероциту. Способ позволяет оценить специфический местный гуморальный иммунитет и усилить антиадгезивную активность общего пула противохолерных иммуноглобулинов. 3 з.п. ф-лы, 2 пр., 2 табл.

1. Способ оценки местного гуморального противохолерного иммунитета в эксперименте, отличающийся тем, что белых мышей иммунизируют 5×10⁷ микробными клетками Vibrio cholerae 5879, через 10 дней выделяют общий пул противохолерных Ig из тонкокишечных промывных жидкостей мышей, дополнительно получают первичную культуру энтероцитов тонкой кишки от интактных мышей, затем противохолерные Ig в двукратном разведении наносят в объеме 3 мл на монослой энтероцитов, сформированных в лунках культуральных панелей, затем в последние наносят живые холерные вибрионы штамма Vibrio cholerae 5879, 40 м.к. на 1 энтероцит и инкубируют в течение 3 часов, после панели трижды отмывают, фиксируют этанолом в течение 20 мин и окрашивают по Романовскому - Гимза, оценку местного гуморального противохолерного иммунитета проводят под микроскопом по количеству вибрионов, окрашенных в темно-синий цвет и прикрепившихся к одному энтероциту.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что общий пул противохолерных Ig получают из промывных жидкостей тонкого кишечника, для этого на последний накладывают две лигатуры на расстоянии 5 см друг от друга и вводят в изолированный участок 5 мл физиологического раствора, массируют и шприцем берут жидкость, которую осаждают 50% сульфатом аммония, а сформировавшийся в течение ночи при 4°C осадок центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 мин.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что первичную культуру энтероцитов тонкой кишки получают от интактных белых мышей, для этого в просвет промытой тонкой кишки животных вводят шприцем 5 мл 0,2% этилендиаминтетрауксусной кислоты, массируют 30 мин и отсасывают содержимое пипеткой, полученные клетки трижды отмывают физиологическим раствором, суспендируют в питательной среде с 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 10 мМ HEPES, 5×10⁵ М 2-меркаптоэтанола, 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина до концентрации 150000 кл/мл и высевают в лунки 6-луночных культуральных панелей Costar, после панели инкубируют в CO₂-инкубаторе в течение суток для формирования разреженного монослоя, затем клетки трижды отмывают свежими порциями среды без сыворотки.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что для проведения иммунизации животных штаммом Vibrio cholerae 5879 последний выращивают при 37°C в течение 24 ч на агаре Мартена (pH 7,6) с последующей инактивацией с помощью кипячения на водяной бане в течение 30 мин и проверки на специфическую стерильность.