Способ окраски гиалуроновой кислоты в тканях глаза Советский патент 1984 года по МПК G01N1/30 G01N33/48 A61B10/00 

со

D (л Изобретение относится к медицине а именно к гистохимическим исследованиям в области офтальмологии. Известен способ окраски гиалуроновой кислоты, включающий фиксацию, окрашивание альциановым синим и исследование в электронном микроскопе.1. Однако данный способ не дает спе цифичной окраски гиалуроновой кисло ты, а выявляет весь комплекс мукополисахаридов. Наиболее близким к предлагаемому является способ окраскиjгиалуроново кислоты, включающий фиксацию, окрашивание рутениевым красным и исслед вание в электронном,микроскопе 2. Однако известный способ не дает возможности четко дифференцировать гиалуроновую кислоту в тканях глаза так как рутениевый красный, вступая в комплекс с гиалуроновой кислотой, дает грубый осадок, что мешает выяв лению точного расположения и количества гиалуроновой кислоты. Цель изобретения - повьшение диф ференцировки гиалуроновой кислоты от других мукополисахаридов. Указанная цель достигается тем, что согласно способу окраски гиалз)роновой кислоты в тканях глаза окра шивание проводят до фиксации в 2550%-ном водном растворе полиэтиленимина 18-24 ч при 10-15°С. Полиэтиленимин является синтетическим продуктом полимеризации этиленимина. В химической промьшшеннос ти полизтиленимин используется при .производстве бумаги для ускорения обезвоживания бумажной массы, а так же- в качестве флокулята при очистке промьшшенных и бытовых сточных вод. Выявлено, что полиэтиленимин, соединяясь с гиалуроновой кислотой, восстанавливает осмиевую кислоту с образованием электронно-плотного осадка. Способ осуществляют следующим образом. Ткань глаза помещают в растворы полиэтиленимина (25-50%) на 18-24 ч при 10-15®С. Далее ткань перейосят в 1%-ный раствор осмиевой кислоты на фосфатном буфере с рН 7,3 на 30 мин. Затем переносят во вторую смену того же раствора осмиевой кислоты на 60 мин. После чего ткань обезвоживают в спиртах Возрастающей концентрации и заключают в эпоксидные смолы. Ультратонкие срезы перед просмотром под электронным микроскопом дополнительно контрастируют растворами цитрата свинца. Применение полиэтиленимина в концентрациях менее 25% при времени .обработки меньше 18 ч и температуре ниже значительно снижает контрастность продукта реакции, а применение полизтиленимина в концентрациях больше 50% при времени обработки больше 24 ч и температуре вьш1е 15°С приводит к сильному высушиванию ткани и появлению больших артефактов. Применение полиэтиленимина в концентрациях 25-50% при времени обработки 18-24 ч и 10-15С приводит к образованию четкого электронно-плотного осадка в о.бласти нахождения гиалуроновой кислоты и регистрируется на электроннограммах. Контролем для выявления гиалуроновой кислоты слзЫит предварительная обработки исследуемой ткани ферментом гиалуронидазой, для чего ткань помещают в раствор гиалуронидазы на 18 ч при . Обработанная гиалуронидазой ткань глаза при последующей окраске полиэтиленимином недает выпадения осадка в области наличия гиалуроновой кислоты, что подтверждает специфичность взаимосвязи полиэтиленимина с гиалуроновой кислотой. Пример 1. Фрагмент роговицы помещают в 25%-ный раствор полиэтиленимина на 24 ч при- . Далее роговицу переносят в 1%-ный раствор осмиевой кислоты на фосфатном буфере с рН 7,3 на 30 мин. Затем роговицу помещают во вторую порцию того же раствора на 60 мин, после чего обёзвожиряют в спиртах возрастающей концентрации и заключают в эпоксидные смолы. Прим ер .2. Фрагмент роговицы помещают в 35%-ный раствор полиэтиенимина на 24 ч при iO°C, далее обработка материала проводится анаогично примеру 1. П р и м е р 3. Фрагмент стеклоидного тела помещают в 50%-ньй растор полиэтиленимина на 24 ч при . алее обработка проводится аналогичо примеру 1.

310910564

Предлагаемый способ найдет приме- ческого состояния глаза, обуслрвленнонение в офтальмологических клиниках го наруйением обмена сахароз в ткаи лабораториях при оценке патологи- нях глазного яблока.

СПОСОБ ОКРАСКИ ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ В ТКАНЯХ ГЛАЗА, включающий их фиксацию, окрашивание, заключение в смолы и исследование в электронном микроскопе, отличающийся тем, что, с целью повьппения дифференцировки гиалуроновой кислоты от других мукополисахаридов, окрашивание проводят до фиксации в 25-50%-ном водном растворе полиэтиленимина 1824 ч при 10-15 С.