Способ получения кислотоустойчивых штаммов дрожжей Советский патент 1984 года по МПК C12N1/16 C12N15/00 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способам получения кислотоустойчивых штаммов дрожжей, способных развиваться при низких значениях рН, при которых нет развития бактериальной микрофлоры, инфицирующей .процесс получения кормовой биомассы 6 нестерильных условиях. Известен способ получения ацидотолерантных штаммов дрожжей Candida scottii КС-2 Hansenuta anama a БЦ-3 продуцентов биомассы из гидролизатов древесины в хемостате. При значениях рН 3,0-3,5 получают асоциацию с экономическим коэффициентом 45% как у исходной формы при рН 4,5 l. / Однако экспериментально полученны штаммы,сохраняемые на cycyto-arape и в лиофилизированном состоянии, через 6-12 мес утратили способность роста на гидролизных средах при р Н 3,5 и ревертировали к исходным формам. Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемо му эффекту является способ получения кислотоустойчивых штаммов дрожжей, предусматривающий выращивание дрожжей в непрерывных условиях на питательной среде, содержащей этанол в качестве источника углерода, источники азота, фосфора, микроэлементы, при аэрации среды и снижении рН от заданного в процессе выращивания с последукшшм отбором кислотоустойчивы штаммов 2.. Согласно известному способу получают кислотоустойчивый штамм Candida utilis ВКМ У-1668, растуищй на этиловом спирте. При проточном культивировании в хемостате, снижая рН постепенно с 4,5 до 2,6 в течение 104 генераций, скорость роста культуры увеличивают от D.5;0,01 Ч до 0,3 ч .Из одной клетки, полученной из этой популяции, выделен штамм, ра стущий при рН 2,6 со скоростью роста ф 0,3 ч и экономическим коэффициентом 70% И. Однако данный способ характеризу ется недостаточно низким значением рН роста кислотоустойчивого щтамма, снижением продуктивности при низком значении рН. Целью изобретения является повьш1е ние кислотоустойчивости штаммов и скорости их роста. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения кислотоустойчивых штаммов дрожжей, предусматривающему выращивание дрожжей в непрерывных условиях на питательной среде, содержащей этанол в качестве источника углерода, источники азота, фосфора, микроэлементы, при аэрации среды и снижении рН от заданного в процессе выращивания с последующим отбором кисдотоустойчивых штаммов, снижение рН в процессе выращивания осуществля ют с 2,5 до.2,О.а отбор кислотоустойчивь1х штаммов ведут при достижении максимальной скорости роста культуры, равной 0,45-0,6 ч . Сущность способа заключается в следующем. Процесс ведут в режиме рН-стата с постепенным снижением рН с 2,5 до 2,0, при авт селекции спонтанно возникшей кислотоустойчивой формы и сохранении культуры, вьщеленной из одной: клетки на жидкой среде при рН 2,0-1,7 и температуре , в коллекции. Сущность метода рН-статного культивирования заключается в том, что выращивание дрожжей ведут в ферментере, в среде устанавливают значение рН, замедляющее рост исходной культуры. При росте дрожжей среда подкисляется вследствие использования физиологически . кислого субстрата сульфата аммония, рН-электрод, регистрирующий это подкисление связан с устройством, открывающим доступ титрующему агенту. Титрующим агентом является питательная среда с рН 6,6. Подача среды автоматически осуществляется по сигналу смещения рН культурой. Культура растет со скоростью, максимальной в данных условиях рН. Культуру, вьоделенную из одной клетки, сохраняют без потери кислотоустойчивости и без снижения экономического коэффициента на жидкой среде с этанолом, вместо обычного хранения дрожжей на скошенном суслоагаре, в холодильнике при темпера- i туре 1-10 С. «Этот интервал температу ры хранения не приводит к гибели клеток из-за замерзания и не допускает активной жизнедеятельности, что способствует длительному сохранению жизнеспособности в анабиотическом состоянии. При этом экстремально низкое значение рН 2,0-1,7 не убивает клетки в течение нескольких месяцев. 1 Пример 1. Дрожжи Candida utilis ВКМ -1668 (находятся на хранении во Всесоюзной коллекции микроорганизмов с 06.07.73 г.) выращивают при температуре 30 С в аэробных усгловиях при непрерывной подаче воздуха в количестве 2-3 л/мин и перемешивании мешалкой (400 об/мин) в условиях рН-стата в 2-литровом ферментере, содержащем 0,5 с. среды следующего состава, г/л: спирт 7,0} КНР04 l,0;(WH4) 1,5; MgSQi 0,2; микроэлементы,вода дистиллированная. Исходная культура растет при рН .2,5 медленно, скорость роста 3) 0,07 ч из-за ингибирования роста высокой кислотностью. Через 106 генераций рост ускоряется из-за появ ления более кислотоустойчивого варианта, который вытесняет исходную форму. Культивирование ведут до тех пор, пока скорость роста рН 2,0 не достиг нет максимального значения. После автоселекции кислотоустойчивой популяции, растущей со скоростью роста 2) 0,45 ч и экономическим коэффициентом 70%, из ферментера проводят выделение серий культур из одной клетки. Проверяют рост методом периодического культивирования в колбах при 200 об/мин и температуре 30°G приначальном зна чении рН 4,5 и 2,2. Значение рН в процессе роста снижается до 1,7.При рН 4,5 исходная и кислотоустойчивая формы растут одинаково. При началь.ном значении рН 2,5 с высокой скоро стью растет только кислотоустойчивый штамм. Хранение полученной формы осущест вляют на указанной жидкой среде при рН 1,7 в холодильнике при . Пересевы на ту же среду делают один раз в месяц. Полученные формы сохраняют уже более года. Пример 2. Дрожжи Candida lambica, ВСБ-579 (промышленный штамм находится на хранении во ВНИИСинтезбелок с 1973 г) выращивают в рН-стате согласно примеру 1. Через 96 гене раций в ферментере селекционировалас 754 популяция, растущая при рН 2,0 с :экономическим коэффициентом 70%. Вы: деляют культуру из одной клетки и проверяют ее рост при рН 2,0 /скорость роста 3) 0,6 ч экoнo iическйй коэффициент 70%, содержание истинного белка.45%). Культуру сЬхраняют согласно примеру 1 при температуре . Пример 3. Дрожжи Endomyces magnusll У-261 (находятся на хранении в ИБФМ АН СССР) выращивают в режиме рН-стата, согласно примеру 1 на синтетической среде следующего состава, г/л: этанол 7,0; ( ЬО/ 1,0; 0,1; . 2,0; 0,5; NaCt 0,1; дрожжевой экстракт 2,5; микроэлементы. Исходная культура при рН 4,0 растет со скоростью, роста 15 0,12 ч .После автоселекции 35 0,12 . После автоселекции при постепенном снижении рН до 2,2 через 60 генераций скорость роста культуры увеличивается до 55, -0,25 ч экономический коэффициент 71%. Культуру сохраняют согласно примеру 1 при температуре , рН 2,0. Предлагаемый способ позволяет по сравнению с известным получать кислотоустойчивые штаммы дрожжей, : растущие на этиловом спирте при низких значениях рН 2,2-2,0 с максимальной скоростью роста D 0,45-0,60 ч экономическим коэффициентом 70% и сохранением кислотоустойчивых культур, .выделенных из одной клетки, в коллекциях. Применение кислотоустойчивых штам мов позволит промышленности, производящей кормовые дрожжи на этаноле, получать продукт, не инфицированный бактериями, так как рН 2,0-2,2 лежит 1даже уровня кислотности, допуска ющего развитие гетеротрофных бактерий. При этом производительность промышленного процесса не снижается, так как экономический коэффициент и скорость роста полученных вариантов не отличается от таковых исходных I форм при рН 4,5, принятом в промыш енности.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КИСЛОТОУСТОЙЧИВЫХ ШТАММОВ ДРОЖЖЕЙ, предусматг ривающий выращивание дрожжей в непрерывных условиях на питательной среде, содержащей этанол в качестве источника углерода, источники.азота, фосфора, микроэлементы, при аэрации среды и снижении рН- от. заданного в процессе выращивания с последующем ртбором кислотоустойчивых штаммов, , отличающийся тем, Что, с целью повышения кислотоустойчивост ти штаммов и скорости их роста, снижение рН в процессе выращивания осуществляют с 2,5 до 2,0, а отбор кислотоустойчивых штаммов ведут при достижении максимальной скорости (Л роста культуры, равной 0,45-0,6 .