Способ получения биомассы дрожжей Советский патент 1993 года по МПК C12N1/16 C12N1/32 C12N1/16 C12R1/72 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и представляет собой способ получения биомзссы дрожжей на этиловом спирте.

Целью изобретения является улучшение качества целевого продукта за счет предотвращения его инфицированности посторонней микрофлорой.

Способ заключается в том, что дрожжи Candida vallda ВКМ У-2327 с ярко выраженными термотолерантными свойстсзами (обнаружены способности роста при 50-53°С) культивируют на питательной среде, содержащей этиловый спирт и минеральные соли в качестве источника азота, фосфора и микроэлементов. В случае инфицирования либо с профилактической целью проводяттер.мо- обработку при темп ературе ВО-53 С и тече- ние 0,25-1,0 ч, затем продолжают культивирование.

Для изучения выживаемости дрожжевой мезофильной микрофлоры были поставлены специальные эксперименты. С этой целью из ВКМ были получены 20 штаммов мезофильных дрожжей, растущих на минеральной среде с этанолом. Кроме того, для сравнения исследовали некоторые термотолерантные штаммы дрожжей.

Штаммы дрожжей раздельно выращивают на скошенном сусло-агаре при температуре 28°С в течение 48 ч. .Затем с косяка делают смыв 3 мл стерильной гзодопровод- ной-воды, осторожно встряхивают пробирку, культуру смывают с поверхности агаризованной среды и полученную суспензию клеток в количестве 1 мл вносят в заранее приготовленные колбы на 500 мл с 100 мл среды 8-Е следующего состава (на 1 л): (NH4)2HPO/i 1,5 г; KH.POl 0,7 г; MgSO-v 7Н20 0,8 г; fx aCi 0,05 г; FeSO.r бНаО 16,7 мг; CaCl2- 2Н20 0:66 мг; ZnSO/ - 6H20 0,13 мг; CuS04- 5Н20 0,16мг; MnSO/i 0,15 мг; CoCS2 6Н20 0,18 мг; этанол 1 об.%; дрожжевой автолизат 0,2 об.%.

Выращивание проводят в колбах на качалке при28°С в течение 48 ч. Далее из колб делают отбор проб в количестве 3 мл и проводят высев на чашки Петри с сусло-агаром в количестве 0,05 мл (контроль). Затем суспензию клеток прогревают в ультратермостате при (50-53°С) ± 0,5°С в течение 30-60 мин, после чего делают высеп по 0,05 мл на чашки с сусло-агаром (опыт). Чашки инкубируют при 28°С в течение 72 ч. По истечении указанного срока проводят просмотр выросших колоний, Оценка визуальная по пятибалльной шкале, где 5 баллов - обильный рост, 4 балла - хороший рост, 3 балла - средний рост, 2 - слабый рост.

1 балл едва различимый рост, О - отсутствие роста.

Результаты исследования представлены в таблице. Из таблицы видно, что из 22

исследованных штаммов дрожжей в результате термообработки при 53°С в течение 30 мин способность к размножению сохраняется у Шести штаммов дрожжей, а выдерживание штаммов при этой же температуре в

0 течение SO мин приводит к потере жизнеспособности всех исследованных мезофильных штаммов дрожжей.

Во всех экспериментах проводят контроль на загрязнение посторонней микро5 флорой в процессе культивирования путем микроскопироваиия, а также высева суспензии клеток на чашки Петри с суслом-агаром. . С этой целью берут 0,5 мл суспензии и делают разведение в 100000 раз стерильной во0 допроводной водой. Высев проводят в количестве 100-200 клеток на чашки Петри с суслом-агаром. Чашки инкубируют при 28°С в течение 72 ч.

По истечении указанного срока про5 сматривают выросшие колонии дрожжей. Наличие посторонней дрожжевой микрофлоры определяют по присутствию колоний разной формы, цвета, консистенции и другим морфологическим признакам.

0 Пример Штамм Candida valida ВКМ У-2327 хранят на скошенном сусле-агаре в пробирке, закрытой ватно-марлевой пробкой, при температуре 4-б С. Штамм выращивают па косяке с суслом-агаром при 37°С

5 в течение 13 ч.

Для получения инокулята (первой стадии) в пробирку с культурой Candida vallda ВКМ У-2327 вносят около 5 мл стерильной водопроводной воды, осторожно встряхи0 вают пробирку, смыоают культуру с поверхности агаризованной среды и полученную суспензию вносят в стерильный биологический матрац с заранее приготовленной пло1цадкой сусла-агара. Суспензию рав5 номерно распределяют по поверхности сусла-агара и выращивают при 37°С в течение 18ч.

Для получения инокулята (второй стадии) в биологический матрац с культурой

0 (инокулят первой стадии) вносят около 50 мл стерильной воды и, осторожно покачивая матрац, смывают культуру с поверхности згаризозанной среды. Полученную суспензию переносят в стерильную колбу с отрост5 ком и получают инокулят второй стадии, который используют для засееа среды в ферментере.

Выращивание Candida vaiide 8КМ У- 2327 в ферментере АНКУМ-2М проводят в режиме хемостата при лимитировании роста клеток этанолом на модифицированной среде 8-Е следующего состава (на 1,0 л): (NH4)2HPO/) 1,5 г; КН2Р04 0,7 г; MgSO/j 7Н20 0,8 г; NaCI 0,05 г; бНаО 16,7 мг,- CaCl2- 2Н20 0,66 мг; ZnS04- 6Н20 0,18 мг: 5Н200,16 мг; МпЗОд 4Н20 0,15 мг; CoCl2- 6Н20 0,18 мг; этанол 1 об. %.

Температуру 36°С поддерживают на заданном уровне в пределах ±0,5°С. Значение рН среды устанавливают равным 4,0 ± ±0,1 автоматической подтитровкой 1% . Скорость протока в хемостате устанавливают 0,25 ч . Парциальное давление кислорода в среде (р 02) поддерживают 40- 50% от насыщения, Отбор проб для анализа проводят после трехкратной смены объема среды в ферментере. После установления стационарного состояния культуры в условиях хемостата (оптическая плотность, температура, рН, р 02) проводят термообработку. С этой целью отключают проток в ферментере, температуру повышают до 50°С и культуру выдерживают в этих условиях в течение 30 мин, после чего снова подключают проток. Стационарное состояние культуры после термообработки наступает через ч. В указанных условиях термообработки клетки штамма Candida vadda В KM У-2327 остаются жизнеспособными на 59% и сохраняют способность к размножению.

П р и м е р 2. Осуществляют, как описано в примере 1, но термообработку проводят при 50°С в течение 60 мин.

В указанных условиях штамм Cabdida valida В KM У-2327 сохраняет жизнеспособность, а также способность к размножению на 23%. Стационарное состояние культуры после термообработки наступает через 7-8 ч.

Примерз. Осуществляют, как описано 8 примере 1, но для засева ферментера используют смесь двух штаммов (1;1)-Candlda valida ВКМ У-2327 и Candida utilis ВКМ У- 2332. После установления стационарного состояния в условиях хемостата (оптическая плотность, рН, р 02) проводят термообработку при температуре 50°С 30 мин. В указанных условиях термообработки клетки штамма Candida utilis ВКМ У-2332 погибают полностью, а у штамма Candida vaiida ВКМ У-2327 отмирает 41% клеток. Таким образом, в результате термообработки в культуре не остается дрожжей С. utilis ВКМ У-2332. а дрожжи. С.valida ВКМ У-2327 сохраняют жизнеспособность на 59 %, а также способность к размножению. Стационарное состояние культуры в условиях хемостата наступает через 7-8 ч после термообработки.

П р и м е р 4. Осуществляют, как описано в примере 3, но термообработку проводят при температуре 50°С в течение 60 мин. В указанных условиях термообработки клетки 5 штамма С.utilis ВКМ У-2332 погибают полностью, а у штамма С.valida ВКМ У-2327 отмирает 77% клеток. Таким образом, в результате термообработки в культуре не остается дрожжей С.utilis ВКМ У-2332, а 10 дрожжи С.valida ВКМ У-2327 сохраняют жизнеспособность и способность к размножению на 23%. Стационарное состояние культуры в условиях хемостата наступает через 7-8 ч после термообработки. 15П р им ерб.Осуществляют, как описано

в примере 3, но термообработку проводят при температуре 53°С в течение 15 мин. В указанных условиях термообработки клетки штамма С.utilis ВКМ У-2332 погибают пол- 0 ностью, а у.штамма C.valida ВКМ У-2327 отмирает 80,2% клеток. Таким образом, в результате термообработки в культуре не остается дрожжей С.utilis ВКМ У-2332, а дрожжи C.valida ВКМ У-2327 сохраняют 5 жизнеспособность на 19,8%.

П р и м е. р 6. Штамм дрожжей C.valida ВКМ У-2327 выращивают, как описано в примере 1. После установления стационарного состояния в условиях хемостата в фер- 0 ментер дополнительно вносят смесь следующих штаммов мезофильных дрожжей:

C.aaserlВКМУ-1425

C.foliorumВКМУ-1453

5C.steatolyticaВКМ У-2596

C.vartiovaaralВКМУ-2115

Rhodotorula glutinisВКМ У-749

Torulopsis camarellli ВКМ У-1485 T.schataviiВКМУ-2094

0C.BIankilВКМУ-2100

C.sifvatlcaАКМ У-2597

C.vartiovaaraiВКМУ-2114

Cryptococcus laurentl ВКМ У-1627 Rh.muclleginosaВКМ У-80

5 T.lnconsplcuaВКМУ-740

C.kefyrВКМУ-257

Штаммы дрожжей раздельно выращивают на косяках с суслом-агаром при температуре 28°С в течение 48 ч. Затем с каждого 0 косяка делают смыв 5 мл стерильной водопроводной воды, осторожно встряхивают пробирку, культуру смывают с поверхности агаризованной среды и полученную суспензию переносят в стерильную колбу с отрост- 5 ком. Полученный инокулят вносят в ферментер. После установления стационарного состояния е условиях хемостата (оптическая плотность, температура, рН) отключают проток, температуру повышают до 50°С и культуру выдерживают с этих условиях в течение 60 мин, после чего снова подключают проток. Стационарное состояние культур в условиях хемостата наступает через 8 ч после термообработки.

В указанных условиях термообработки подавляющее большинство колоний составляют колонии штамма дрожжей C.vaiida ВКМ У-2327 и отдельные колонии других штаммов дрожжей, отличающихся по форме.

Пример. Осуществляют, как описано в примере 6, но термообработку проводят при 53°С в течение 60 мин.

В указанных условиях термообработки способность к размножению сохраняет только штамм C.vaiida ВКМ У-2327. Стационарное cocfoяниe штамма C.vaiida ВКМ У- 2327 в условиях хемостата после термообработки наступает через 8 ч.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет по сравнению с известным предотвратить размножение посторонней дрожжевой мезофильной микрофлоры или очистить ot нее производственную культуру.

При такой технологии получения биомассы дрожжей на этаноле C.vaiida ВКМ

У-2327 можно избавиться от загрязнения культуры посторонними мезофильными дрожжами как в отделении чистой культуры, так и в промышленных аппаратах для выращивания дрожжей C.vaiida ВКМ У-2327. Реализация данного преимущества штамма обеспечивает стабильность технологического процесса и облегчает получение продукта постоянного высокого качества,

(56) Авторское свидетельство СССР №442204, кл, С 12 С 1/16, 1974.

Chlstyakova Т. I.. MInkevlch 1. G., Eroshin V. К. Growth of the Thermotolerant. Yeast Candida valida on Ethanol: Dependences of

Naximai Growth Rate and Cell Blomass Jleld on Temperature, Eur, I. Appi. Microhlol. Blotechnol., 1983, 18, p. 225-228.

Примечание: 5 баллов - обильный рост, 4 балла - хороший рост, 3 балла - средний рост, 2 балла - слабый рост, 1 балл - едва различимый рост, О - отсутствие роста.

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ ДРОЖЖЕЙ, предусматривающий непрерывное культивирование их в условиях аэрации на жидкой питательной среде, содержащей этанол в качестве источника углерода, источники азота, фосфора,

Редактор Н.Тимонина

Составитель Техред М.Моргентал

Заказ 3333

ТиражПодписное

НПО Поиск Роспатента 113035. Москва. Ж-35, Раушская наб.. 4/5

Производственно-издательский комбинат Патент, г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Продолжение таблицы

минеральные соли и микроэлементы, отличающийся тем, что, с целью улучшения качества целевого продукта за счет предотвращения его инфицированности посторонней микрофлорой, в процессе выращивания дрожжи выдерживают при температуре 50 - 53 С в течение 0,25 -1,0ч.

Корректор Л.Пилипенко

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в чааности к способам получения биомассы дрожи ей на этаноле. Целью изобетения является улучшение качества целевого продукта за счет предотвращения его инфицированности посторонней микрофлороЯ Штамм Candida valida ВКМУ-2327 выращивают в режиме хемостата .при лимитировании роста клеток этанолом на модифицированной среде 8-Е при температ и jrfH 4,0. .Скорость протока ч . Парй1иальное давление кислорода в среде 40 - 50% от насыщения После уаановления стационарного соаояния iQffibTypbi проводят термооб1 ботку, для чего отлю- чают проток в ферментере, температуру повышают до 50 - 53% и выдерживают культу в течение 025 - 1,0 ч после чего снова подключают проток Стационарное состояние куга)Туры после термообработки наступает через 7 - 8 ч Способ основан на обнаруженной способности штамма Candida salida ВКМУ-2327 расти при температуре 55 - 60°С и позволяет улучиить качестю поучаемой би шассы за счет предотфащения ее инфящфо- ванности посторонней микрофлорой. 1табл