СПОСОБ ОЧИСТКИ КРОВИ ОТ АНТИТЕЛ К ТИРЕОИДНЫМ ГОРМОНАМ С ПОМОЩЬЮ ИММОБИЛИЗИРОВАННОГО ГРАНУЛИРОВАННОГО МАГНИТОУПРАВЛЯЕМОГО ПРЕПАРАТА Российский патент 2009 года по МПК G01N33/543 

Изобретение относится к области медицины, иммунологии и биотехнологии, и может быть использовано для совершенствования диагностики поражения щитовидной железы при аутоиммунных заболеваниях.

Антитела к тиреоидным гормонам (тироксину - Т4 и трийодтиронину - Т3), образующиеся при аутоиммунном процессе влияют на количество свободных форм гормонов, циркулирующих в крови, блокируя их, что приводит к уменьшению их сывороточного количества и образованию повышенного уровня измененных форм (например, реверсивного трийодтиронина). С увеличением содержания антитиреоидных антител клинически наблюдается прогрессирование аутоиммунного процесса в щитовидной железе и других органах, поскольку гормоны щитовидной железы оказывают выраженное влияние на все виды обмена и метаболические процессы в организме. Поэтому удаление этих антител из сыворотки крови больного приводит к улучшению течения аутоиммунного заболевания и уменьшению клинических симптомов тиреоидного поражения.

В настоящее время наиболее распространенными методами очистки крови от антител являются плазмаферез, гемосорбция и лимфосорбция плазмы крови. Основным недостатком всех этих методов является снижение количества форменных элементов крови за счет их деструкции в процессе проведения экстракорпорального лечения (тромбоцитов после каждой процедуры сорбции становится меньше на 80%, лейкоцитов на 25%, лимфоцитов уменьшается примерно в 2 раза), низкая специфичность, приводящая к элиминации из организма как патогенных антител, так и нормальных иммуноглобулинов, альбумина, гормонов, транспортных белков, лекарственных препаратов и т.д. Это вызывает, в частности, существенное повышение частоты возникновения тяжелых бактериальных и вирусных инфекций. В то же время проводимая в ходе этих экстракорпоральных методов инфузионная терапия не обеспечивает адекватного плазмозамещения. Используемые с этой целью в больших количествах (до 60% от общего объема) белковые препараты (альбумин, протеин, плазма) являются чужеродными для организма больного и вызывают его дополнительную сенсибилизацию, а также их высокая цена повышает стоимость метода и препятствует его широкому использованию.

Известен метод удаления антитиреоидных антител из крови путем пропускания ее через иммуносорбент (тиреоидный гормон), представляющий собой нерастворимый инертный носитель (агарозный гель в форме сефарозы CL-2B или сефарозы CL-48). [Ермоленко М.Н., Пышко Е.С., Свиридов О.В. и др. «Способ очистки антител к тиреоидным гормонам» / патент на изобретение №4221846/14, 1994 г.]. В дальнейшем данный метод обозначается как прототип.

В прототипе антисыворотку инкубируют с аффинным сорбентом, который представляет собой тиреоидный гормон, ковалентно иммобилизованный на нерастворимой матрице (Т₃- или Т₄-сефароза) (присоединяемый к сефарозе с помощью ацетонитрила по гидроксильной группе) и далее промывают раствором NaOH с pH 10,0-12,0, а затем осуществляют десорбцию антител 15-50%-ным водным раствором ацетонитрила при pH 2,0-4,0. В качестве исходного материала в прототипе использовалась кровь лабораторных животных (кролики породы шиншилла) - 2 мл кроличьей антисыворотки, максимальная связывающая емкость которой составляет 2,64×10^-8 моль T₄. Аффинным сорбентом служит Т₄-сефароза, содержащая 5×10^-7 моль Т₄ на 1 мл уплотненного геля. Таким образом, для насыщения антисыворотки необходимо 0,053 мл геля Т₄-сефарозы, а 10-кратный избыток составляет примерно 0,5 мл.

У указанного способа есть ряд недостатков. Сефароза имеет крайне высокую стоимость, и поэтому не может найти широкого применения для приготовления иммуносорбентов в клинической практике. Ацетонитрил, используемый для активации данного носителя, является высокотоксичным соединением (класс опасности 3), работа с ним представляет опасность для исследователя. При вдыхании ацетонитрила возникают судороги, боли в животе, рвота, затрудненное дыхание и потеря сознания, что требует проведения ИВЛ, а в большой дозе может вызывать смерть. К тому же ацетонитрил проникает через кожу. Данное вещество также огне- и взрывоопасно, при температуре выше 12,8°С могут образовываться взрывоопасные смеси пар/воздух, что требует определенных условий работы с данным веществом (закрытого типа вентиляция, защищенное от взрыва электрооборудование и пр.) [Химическая энциклопедия, М., 1988 г., стр.68-70; по данным Института Промышленной Безопасности, Охраны труда и Социального партнерства, Санкт-Петербург, 2007 г. /www.safework.ru/; Kirk-Othmer encyclopedia, 3 ed., v.15, N.Y., 1981].

При приготовлении сефарозы из агарозы существенная часть активных групп носителя блокируется поперечной сшивкой геля. В процессе образования ковалентных связей между матрицей и лигандом происходит частичное блокирование активных центров молекулы антигена по OH-группе. Кроме того, в прототипе не проводились методы очистки сыворотки крови от антител к Т3 и Т4 у пациентов с аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы, а также не была проведена оценка травматизации и изменения количества форменных элементов после процедуры сорбции. Недостатком прототипа также является сравнительно небольшая сорбционная емкость, ограниченная, достаточно большим диаметром частиц носителя, что резко снижает рабочую площадь такого препарата.

Решаемая задача состоит в разработке способа снижения содержания антител к гормонам щитовидной железы путем пропускания крови через предварительно полученный методом эмульсионной полимеризации в потоке газообразного азота оригинальный гранулированный магнитоуправляемый препарат с иммобилизированной формой тиреоидного гормона (тироксин или трийодтиронин) (далее - препарат), что обеспечивает более значительное снижение концентрации антитиреоидных антител с минимальными затратами.

Технический результат заявляемого изобретения представляет собой увеличение эффективности по сравнению с прототипом за счет более высокой рабочей площади препарата и упрощения манипуляций с препаратом за счет его магнитоуправляемости, равно как и уменьшение расхода препарата за счет возможности эффективной многократной регенерации препарата. Это достигается путем применения полиакриламидного носителя с магнитными свойствами в качестве структурного элемента ковалентно иммобилизированной формы тиреоидного гормона (тироксин или трийодтиронин) (присоединяемый к полиакриламиду по гидроксильной группе при помощи глутарового альдегида), который вводят в гранулированный препарат методом эмульсионной полимеризации.

Способ очистки крови от антитиреоидных антител с помощью иммобилизированных гранулированных магнитоуправляемых препаратов осуществляют нижеописанным образом.

Получение препарата производится следующим способом. В сосуд, содержащий гексан и эмульгатор, подается под давлением по трубке химически инертный газ таким образом, чтобы создавать интенсивное перемешивание. В колбу для полимеризации вносится раствор окиси железа с гидрофильными свойствами и персульфат аммония, затем добавляется раствор, содержащий мономеры акриламида, метиленбисакриламида, растворимая форма тиреоидного гормона (полученная из коммерческого препарата, «Берлин-Хеми», Германия) и NNN'N'-тетраметилэтилендиамина. После завершения полимеризации гранулы отмываются от непрореагировавших мономеров, эмульгатора и гексана. Далее проводится этап активации гранул 20% водным раствором глутарового альдегида (pH-7,4), что обеспечивает сшивку полиакриламида с тиреоидным гормоном, включенным в гранулу. Затем активизированные гранулы снова инкубируют в течении 18 часов с тироксином или трийодтиронином для создания двойного слоя препарата в грануле и отмывают 10 объемами забуференного физраствора (pH 7,4).

Регенерация препарата производится путем пропускания через колонку 0,1 М буфера глицин-HCl (pH 2,5) два раза по 10 минут и последующим отмыванием забуференным физраствором.

Пример 1. Получение полиакриламидных гранул с магнитными свойствами с иммобилизированной формой тироксина.

В 2 мл 0,15 М раствора натрия хлорида растворяли соответственно 100 мг и 300 мг метиленбисакриламида и акриламида (Реанал, Венгрия), а также 0,2 мг тироксина (Берлин-Хеми, Германия). Выбор концентрации антигена 0,1 мг/мл (в 2 мл - 0,2 мг) обусловлен тем, что в прототипе использовалась именно эта концентрация гормона.

В сосуд, содержащий 100 мл гексана и 0,5 мл эмульгатора СПЭН-85, подавали под давлением 0,2-1 атм газообразный азот по трубке сечением 0,8 мм таким образом, чтобы создавать интенсивное перемешивание в течение 5 мин. В колбу для полимеризации вносили 1 мл физиологического раствора pH 7,4 с 200 мг окиси железа с гидрофильными свойствами и 10 мг персульфата аммония, через 1-2 мин добавляли 2 мл раствора, содержащего мономеры акриламида, метиленбисакриламида, тироксина и 20 мкл NNN'N'-тетраметилэтилендиамина.

После завершения полимеризации гранулы в течение 10 мин отмывали ацетоном и физиологическим раствором с детергентом Твин-20 (0,05%) от непрореагировавших мономеров, эмульгатора и гексана. Затем проводится активации гранул 20% водным раствором глутарового альдегида (pH 7,4), что обеспечивает сшивку полиакриламида с тиреоидным гормоном, включенным в гранулу. После чего активированные гранулы снова инкубируют в течение 18 ч с тироксином для создания двойного слоя препарата в грануле и отмывают 10 объемами забуференного физраствора (pH 7,4).

Гранулы имели стандартную сферическую форму с размером частиц геля 10-100 мкм. Соотношение полимерный носитель: железо = 2:1 (в пересчете на сухую массу).

Под микроскопом (объектив 8, окуляр 10) подсчитывали количество гранул в 0,05 мл 50%-ной взвеси. Средний диаметр гранул определен экспериментально и равен 55±6,2 мкм. Далее рассчитывали площадь поверхности гранул, соответствующую объему 40 мл (так как в прототипе использовалась колонка такого же объема). В результате расчетная площадь поверхности гранул прототипа составила 44,11 см² заявляемого образца - 330,1 см², что в 7,5 раз больше.

Пример 2. Получение полиакриламидных гранул с магнитными свойствами с иммобилизированной формой трийодтиронина.

Концентрация антигена в данном случае составила 0,1 мг/мл (в 2 мл - 0,2 мг), так как в прототипе использовалась именно эта концентрация гормона. Дальнейшие операции проводят как в примере 1.

Пример 3. Сорбция антитиреоидных антител из плазмы крови больного аутоиммунным заболеванием с поражением щитовидной железы.

В колонку объемом 40 мл (что соответствует прототипу), помещенную в устройство, создающее постоянное магнитное поле (напряженность поля 4000-5000 Эрстед), которое удерживает гранулы во взвешенном состоянии, препятствует их адгезии друг с другом и способствует большему контакту сорбента с биологическими жидкостями [Гонтарь И.П., Заводовский Б.В., Зборовский А.Б. и др. «Способ проведения экстракорпоральной иммуносорбции» / патент на изобретение 2098140, 1997 г.], вносили гранулы и перфузировали через нее со скоростью 10 мл/ч по 20 мл сыворотки и нативной гепаринизированной крови, полученной от больных хроническим аутоиммунным тиреоидитом и содержащей антитела к тиреоидным гормонам. Далее препарат отмывали от несвязавшихся белков забуференным физиологическим раствором (pH 7,4) и проводили элюцию 0,1 М буфером глицин-HCl (pH 2,5) два раза по 10 мин. Определяли содержание антител к тироксину (Т4) и трийодтиронину (Т3) в сыворотке исходно и после перфузии методом преципитации с полиэтиленгликолем-6000 по методу Haskova в модификации Лемперта (1988), содержание форменных элементов крови (эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов) до и после процедуры перфузии.

По данной методике проведена обработка сыворотки и нативной гепаринизированной крови 10 больных хроническим аутоиммунным тиреоидитом (ХАИТ). В качестве контроля использовали 10 сывороток здоровых лиц. Динамика концентрации антител к Т3 и Т4 в сыворотке крови в ходе осуществления заявляемого способа приведена в таблице 1, динамика концентрации форменных элементов крови - в таблице 2.

Из приведенных значений следует, что перфузия через препарат вызывает снижение содержания антитиреоидных антител на 99,5%, а при помощи прототипа достигалось снижение содержания их на 93% от исходного количества. При использовании заявляемого способа содержание форменных элементов крови достоверно не меняется.

Пример 4. Регенерация и повторное использование сорбента.

После сорбции гранулы регенерировали 0.1 М глицин-HCl буфером, pH 2,5 и последующим отмыванием 10 объемами забуференного физраствора (pH 7,4). После первой регенерации потеря активности составила 10%, при последующих повторных регенерациях (до 10 раз) потери активности не происходило.

Пример 5. Контроль специфичности сорбента.

1 г гранул перемешивали с 2 мл сыворотки крови донора, не содержащего антител к Т3 и Т4. С интервалом 15 мин в течение 1 ч в ней определяли концентрацию белка по Лоури, иммуноглобулинов классов G, A, M по методу Манчини. Достоверных отличий по сравнению с исходным уровнем отмечено не было. Полученные данные говорят о высокой специфичности сорбента.

Таким образом, предлагаемый сорбент позволяет достигнуть увеличения специфической активности по сравнению с прототипом. Он инертен, имеет низкую неспецифическую емкость, может регенерироваться и повторно использоваться без существенной потери сорбционных свойств. При изготовлении данного иммуносорбента используются более доступные, дешевые материалы и безопасные методы получения иммобилизированных форм по сравнению со сравниваемым образцом. Иммобилизация антигена методом эмульсионной полимеризации позволяет провести как синтез носителя, так и иммобилизацию на нем специфического лиганда. Включение магнитного материала позволяет поддерживать постоянно гранулы во взвешенном состоянии во внешнем магнитном поле, за счет чего уменьшается утечка сорбента за пределы колонки, повышается площадь соприкосновения его с кровью, уменьшается гемодинамическое сопротивление экстракорпорального контура, что практически не приводит к деструктивным влияниям на все форменные элементы крови. Предлагаемый иммуносорбент может использоваться для удаления специфических антител из биологических жидкостей. Его высокая специфичность и эффективность позволит расширить показания к проведению процедуры и улучшить эффект от нее, что будет способствовать улучшению прогноза и течения аутоиммунных заболеваний, сопровождающихся поражением щитовидной железы. Применение метода позволит получить экономический эффект за счет возможности повторного использования гранул у одного и того же больного.

Таблица 1. Изменение содержания атител к Т3 и Т4 в сыворотке крови в результате перфузии через гранулированный магнитоуправляемый препарат с иммобилизированными формами тироксина и трийодтиронина Показатель Содержание антител к тиреоидным гормонам у доноров Содержание антител у больных с ХАИТ Исходно После перфузии Заявляемый образец M±m, Ед, Анти-Т3 Анти-Т4 Анти-Т3 Анти-Т4 Анти-Т3 Анти-Т4 0,034±0,008^** 0,028±0,008^** 0,132±0,027^* 0,156±0,065^* 0,037±0,007 0,039±0,009 %     100 100 0,5 0,4 Прототип, % - - 100 100 7 8 ^* Достоверность различия с содержанием антител после перфузии через заявляемый образец ^** Недостоверность различия с содержанием антител после перфузии через заявляемый образец

Таблица 2. Содержание форменных элементов в крови больных с аутоиммунным поражением щитовидной железы до и после перфузии через гранулированный магнитоуправляемый препарат с иммобилизированными формами тироксина и трийодтиронина Показатель Эритроциты, ×10¹² л^-1 Лейкоциты, ×10⁹ л^-1 Тромбоциты, ×10⁹ л^-1 Исходно После перфузии Исходно После перфузии Исходно После перфузии Заявляемый
образец, M±m, 4,5±1,1 4,2±1,5^** 5,88±1,6 5,1±1,0^** 253,5±56,1 245,3±40,5^** % 100 93,3 100 86,7 100 96,7 ^* Достоверность различия с исходным содержанием форменных элементов ^** Недостоверность различия с исходным содержанием форменных элементов

Изобретение относится к области медицины, иммунологии и биотехнологии. Сущность изобретения заключается в разработке способа снижения содержания антител к тиреоидным гормонам путем пропускания крови через предварительно полученный оригинальный гранулированный магнитоуправляемый препарат с иммобилизированными формами гормонов щитовидной железы на основе полиакриламидных гранул с магнитными свойствами. Изобретение обеспечивает увеличение эффективности и уменьшение расхода препарата по сравнению с прототипом за счет более высокой удельной активности и возможности эффективной многократной регенерации, упрощение манипуляций с препаратом и возможность поддержания взвешенного состояния гранул препарата в процессе сорбции за счет постоянного магнитного поля, что повышает рабочую площадь сорбции, а также снижает травматизацию форменных элементов перфузируемой крови. 2 табл.

Способ снижения содержания антител к тиреоидным гормонам, включающий пропускание крови через гранулированный препарат с иммобилизированной формой тиреоидного гормона (тироксин или трийодтиронин), отличающийся тем, что для иммобилизации гормона используют полиакриламидный носитель с магнитными свойствами при соотношении носитель: железо 2:1, который гранулируют методом эмульсионной полимеризации.