Способ получения аффинных сорбентов для иммуноферментного анализа Советский патент 1991 года по МПК C08B15/06 G01N33/548 

Изобретение относится к получению иммуносорбентов с использованием целлюлозного материала, которые могут быть использованы в иммуноферментном анализе кортизола в биологических жидкостях человека и животных для дифференциального диагноза ряда заболеваний эндокринной системы и контроля за их лечением, а также в иммунобиотехнологии при получении и очистке антител против кортизола методом аффинной хроматографии.

Целью изобретения является создание сорбента, пригодного для анализа кортизола с повышенными емкостью и иммунореак- тивностью.

П р и м е р 1. К 330 мг нитроцеллюлозной мембраны (НЦМ) (в форме кружков с диаметром 0,6 см и геометрической поверхностью 0,565 см ,, массой 1,1 мг каждый) добавляют 60 мл раствора периодата натрия в бидистиллированной воде и выдерживают смесь 1,5 ч при комнатной температуре и постоянном встряхивании Для удаления избытка окислителя приливают 6 мл 4 М этиленгликоля и выдерживают смесь 10 мин. Сорбенты промывают 5 раз 0,1 М би- карбонатным буфером (рН 9,2) по 50 мл. К активированному сорбенту добавляют 16,5 мл раствора конъюгата овальбумина (ОБА) с кортизолом (ОВА-КОР-9) в концентрации 0,70 мг/мл. ОВА-КОР-9 - конъюгат, содержащий 9 молекул кортизола, получен изве- стным способом реакцией ОБА с N-оксисукцинимидным эфиром 3-0-карбок- симетилоксима кортизола, взятого в избытке при 4°С в течение 18 ч и постоянном

VI

О

о

8

сь

перемешивании с последующим диализом против воды. Число связавшихся с ОБА кор- тизолов определяют из спектров поглощения относительно нейодифицированного ОВД.

Г р и меры 2-18. Выполняют аналогично примеру 1 при различных соотношениях компонентов. Данные по всем примерам Сведены в таблицу, Через определенные промежутки времени определяют концент- рацию белка в контактном растворе. По разности содержания белка в контактном растворе до реакции и после нее определяю количество белка, связавшегося с сорбентом, и рассчитывают содержание белка на 1 см геометрической поверхности сорбента. Через 18 ч раствор белка сливают, промывают сорбент 0,1 М бикарбонатным буфером, добавляют 50 мл МаВЬй, выдерживают смесь 1 ч при комнатной температу- ре и постоянном встряхивании. Затем сорбент промывают 0,1 М фосфатным буфером (рН 7,4), содержащим 0,1 % Твина-20, и 0,1 М фосфатным буфером с тем же рН, но без детергента. .

Приготовленный сорбент хранят в том же буфере при 4°С, Сорбент не меняет сво- их свойств в течение 6 мес.

П р и w e о 19. Изучение иммунореактив- ности аффинных сорбентов на основе нит- роцеллюлозных мембран и конъюгатов ОВА-КОР.

К аффинным сорбентам 1 или (таблица) в среде 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,4), содержащего 0,05% Твина-20, при- ливают по 50 мкл антисыворотки против кортизола (АНТИ-КОР) с разбавлением Я :300 и инкубируют смеси 2 ч. Затем добав- Јяют к ним разные концентрации конъюгата вторых антител с глюкозо-6-Фосфатдегид- рогеназой (втор. АТ-Г6ФДГ), содержащего белковые компоненты в соотношении-1:1, и выдерживают смеси еще 2 ч. Раствор сливают и после промывки сорбентов к ним добавляют 1 мл 0,1н. NaOH-глицинового буфера (рН 9,1), содержащего 1,0 мМ глюко- зо-6-фосфата и 0,4 мМ НАДФ. Через 1 ч измеряют оптическую плотность растворов на длине волны 340 нм и регистрируют ее рост, соответствующий накоплению НАДФ.Н в результате ферментативной реакции дегидрирования глюкозо-6-фосфата.

На чертеже представлена зависимость ферментативной активности тройных иммунных комплексов ОВА-КОР:АНТИ - КОР:втор. АТТ6ФДГ на аффинных сорбентах (в единицах оптической плотности Аззо) от концентрации коныогага втор. АТ- Г6ФДГ в контактном растворе: разведение АНТИ-КОР 1:300; кривые 1 и 3 - аффинный

сорбент 17,кривая 2 - сорбент 1,кривая 3 - использована неспецифическая сыворотка крови.

Из приведенных графиков следует, что 0,03 мг/мл коныогата втор. АТТбФДГ достаточно для достижения максимальной скорости маркерной ферментативной реакции тройного иммунного комплекса ОВА- КОР:АНТИ-КОР:втор.АТ-Г6ФДГ на аффинных сорбентах 1 и 17 двух типов (таблица). Неспецифическая сыворотка (кривая 3) не взаимодействует с ОВА-КОР на сорбенте и поэтому иммунный комплекс не образуется. Графики подтверждают высокую иммунореактивность аффинных сорбентов на основе НЦМ и конъюгатов ОВА-КОР и практически полное отсутствие неспецифической сорбции белков из контактного раствора, содержащего иммуноглобулины и конъюгат втор,-АТ-Г6ФДГ.

Таким образом, предлагаемый аффинный сорбент сохраняет способность кортизола, включенного в его состав, взаимодействовать с антителами против этого антигена, т.е. может быть применен в иммуноферментном анализе кортизола.

Способ получения аффинных сорбентов на основе нитроцеллюлозыых мембран и конъюгатов кортизола с белками не требует дорогостоящих реагентов. Конъюгаты БСА- КОР или ОВА-КОР обычно используются для иммунизации животных с целью выделения антисывороток против кортизола и могут быть применены также по другому назначению-для приготовления аффинных сорбентов.

Преимущество предлагаемых аффинных сорбентов заключается в том, что при использовании в качестве белкового компонента ОВА-КОР сорбент имеет минимальную неспецифическую сорбцию антисывороток, полученных после иммунизации животных конъюгатами БСА-КОР, так как белковые компоненты сорбента не взаимодействуют с фракциями антисыворотки, включающими иммуноглобулин против БСА, Целесообразно использовать ОВА- КОР, содержащие сорбенты ,при работе с антисыворотками, полученными после иммунизации животных конъюгатами БСА- КОР, и наоборот, при использовании антисывороток против ОВА-КОР лучше применять сорбенты на основе БСА-КОР.

Преимущества предлагаемым сорбентам дает применение пленочных нитроцел- люлозных мембран с пористой структурой и контролируемым размером пор: адсорбционная емкость НЦМ по отношению к белкам в 14 раз вышз, чем у полистирольных материалов (пробирок, планшетов и г д ). Предлагаемые сорбенты могут иметь любую необходимую форму и особенно перспективны в качестве иммунореактивных носителей в методе индикаторных полос при разработке STAT- анализов и создании самодиагностикумов. Полученные сорбенты позволяют определять концентрации кортизола в сыворотке крови в интервале концентраций Ю 10-1СГ4 моль/л.

Формула изобретения Способ получения аффинных сорбентов для иммуноферментного анализа,включающий обработку целлюлозного материала водным раствором перйодата натрия и последующую стадию иммобилизации на полученном активированном носителе, о т л и0

5

чающийся тем, что, с целью создания сорбента, пригодного для анализа кортизола, с повышенными емкостью и иммуноре- активностью, в качестве целлюлозного материала используют нитроцеллюлозные пленочные мембраны с диаметром пор 0,4- 0,6 мкм, а для иммобилизации - конъюгат бычьего сывороточного альбумина с корти- золом (I) или овальбумина с кортизолом (II), содержащий 9-36 молекул кортизола на 1 молекулу белка, при массовом соотношении нитроцеллюлозной пленочной мембраны и конъюгата I соответственно (97,60--99,40):(0,60-2,40) и нитроцеллюлоз- иой пленочной мембраны и конъюгата It (99,28-98,30):(0,72-1,70).

Изобретение относится к получению им- муносорбентов, используемых для анализа кортизола в биологических жидкостях человека и животных, а также в иммунобиотехнологии при получении и очистке антител против кортизола методом аффинной аро- матографии. Изобретение позволяет создать сорбент, пригодный для анализа кортизола с повышенными емкостью и им- мунореактивностью за счет того, что нитро- целлюлозные пленочные мембраны с диаметром пор 0,4-0,6 мкм активируют водным раствором периодата натрия с последующей иммобилизацией конъюгата бычьего сывороточного альбумина с кортизолом (I) или овальбумина с кортизолом (II), содержащим 9-36 молекул кортизола на молекулу белка. При этом массовое соотношение нит- роцеллюлозной пленочной мембраны с конъюгатом I равно (97.6-99.4):(0,6-2,4), а с коньюгатом II (98,3-99.28):(0,72-1,7). 1 ил , 1 табл. сл с

БСА - бычий сывороточный альбумин.

-о0.030.060,09

Втер. AT- ГвФдг, мг/мл

2 о