Способ предохранения хлорофилла в изолированных мембранах от фотодеструкции Советский патент 1984 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для со здания устойчивых искусственных систем фотобиохимического преобразования энергии и синтеза различных веществ (Hg, 0,, АТФ и т.д.), конкретнее изобретение касается способов защиты хлорофилла от фотодеструкции (фотоокисле- НИН, фотовьщветания). Известны способы защиты хролофилл- 1 содержапщх фотосинтетических мембран в функционирующем режиме от фотодеструкций путем адсорбции на твердых носителях. Стабилизация процесса выделения 02хлорофиллсодержащими мембра-i нами наблюдается при адсорбции на cпe циально обработанных стеклянных буси нах. Активное светоиндуцированное вы деление QI наблюдается при непрерывном освещении с полупериодом жизни системы вьделения более 40 ч Q. Однако адсорбция хлорофиллсодержащих мембран на твердых носителях име ет ряд ограничивающих факторов: прак тически трудно осуществляется адсорб ция крупных мембранных систем, твердый носитель требует специальной слож ной обработки, наносимый объект имее высокую концентрацию хлорофилла, носитель с адсорбированной системой по гружен в раствор, содержащий дорогостоящие стабилизирующие химические вещества. Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемо му эффекту является способ предохранения хлорофилла в изолированных мем бранах от фотодеструкции путем введе ния стабилизаторов. В качестве стабилизаторов используют,например, бычий сывороточный альбумин 2j . Недостатками известного способа является низкая эффективность защиты (фиг. 1), а также сложность получения стабилизатора из пищевого сырья. Целью изобретения является увеличение сроков сохранения хлорофилла в мембранах и упрощение процесса. Поставленная цель достигается способом предохранения хлорофилла в изолированных мембранах от фотодеструкции путем введения стабилизатора, причем в качестве стабилизатора используют экстракт из листьев Danae racemosa, взятый в 800-3000-кратном избытке по отношению к содержанию хлорофилла. Выбор стабилизирующего агентаэкстракта из листьев Danae racemosa обусловлен тем, что гомогенаты из листьев вечнозеленых растений, таких как JDanae racemosa, Ruscus hypophyllum, Nerium Oleander, а возможно и других произрастающих в засушливых районах вечнозеленых растений, устойчивы к фотодеструкции, а хлоропласты, вьщеленные из листьев этих растений, не обладают повьшенной устойчивостью к фотодеструкции. Положительный защитный эффект получен при использовании в качестве защитного агента и буферного экстракта из листьев Ruscus hypophyllum и Danae racemosa. Гомогенаты листьев таких культурных растений, как кукуруза,пшеница,рис,шпинат и др. не обладают устойчивостью к фотодеструкции, а буферные экстракты из листьев этих растений не способны заищщать светособирающий хлорофилловый комплекс от фотрдеструкции. Стабилизирующее действие экстракта увеличивается с увеличением отношения хлорофилл (Хл) экстракт и становится оптимальньм в довольно широких пределах значений Хл/экстракт (1/8001/3000) (фиг. 2). Дальнейшее увеличение отношения Хл/экстракт не приводит к увеличению стабилизирующего эффекта, а наоборот снижает его. Используемое отношение б.уфер/экстракт 1/1 (Хл/экстракт 1/800) лежит в пределах оптимальных значений. Пример. В экспериментах по исследованию возможности защиты хлорофилла от фотодеструкдии реакционная среда содержала буфер (10 мМ трис, 4 мМ К2Н.Р04, 2 мМ Mg-Cf и 30 мМ КС1, рН 7,8), экстракт из листьев Danae racemosa (буфер/экстракт 1/1), О,1 мМ дифенилкарбозид, 0,1 мМ метилвиологен и Хлоропласты с конечной концентрацией хлорофилла, равной 70 мкг/мл. С целью фотоиндуцирования электронного транспорта и создания условий ункционирования хлорофилла в режиме, близком к технологическому, постоянно перемешиваемая в термостатируемой () ячейке реакционная смесь через систему светособирающих и тепловых ильтров освещалась интенсивным (белый свет, 100000 л) светом. Через каждый час снимались спектры поглощения (при 20°С) освещаемой смеси

31

и исследовалась динамика фотовыцвета- ния хлорофиллового комплекса, в зависимости от условий эксперимента по падению оптической плотности в области основного максимума поглощения хлорр- филла при 678 им.

Контролем служила суспензия функционирующих хлоропластов (70 мкг/мл) без экстракта из листьев Danae гасеmosa.

Как показали результаты экспериментов, экстракт из листьев :Danae raceraosa оказывает сильный стабилизирук п91й эффект, что выражается в приблизительно шестикратном увеличеНИИ фотоустойчивости хлорофиллового комплекса в исследуемой суспензии (фиг. 1А) по сравнению с контрольной (фиг. 1Б). С целью достижения наиболе Эффективного стабилизирующего хлорофилл действия экстракта из листьев Danae racemosa в исследуемую суспензию добавляли классический протектор бычий сывороточный альбумин (2% в конечном объеме). В этом случае конТролем служила функционирующая суспензия хлоропластов, содержащая 2% бычий сывороточный альбумин, но лишенная экстракта (фиг. 1Г).

Сравнивая 3(}xJ)eKTHBHocTb действия классического протектора бычьего сывороточного альбумина (фиг.1Г) и экстракта из листьев Danae racemosa (фиг. 1А)на фотоустойчивость хлорофиллового комплекса видно, что стабилизирующий эффект экстракта более чем в А раза .выше действия сывороточного альбумина Стабилизирующее же действие экстракта в сочетании с 2% бычьим сывороточным альбумином становится еще более эффективным (фиг. 1В). Эффект определиется более чем тринадцатикратным уве1544

лйчением фотоустойчивости хлорофил|лового комплекса по сравнению с контролем.

Полученные результаты свидетельствуют о высокой эффективности способ защиты хлорофилла, функционирующего в режиме близком к технологическому, с использованием буферного экстракта из листьев Danae racemosa, вводимого в реакционную среду.

Приготовление экстракта заключалось в тщательном растирании 750 мг сухих листьев Danae racemosa в 10 мл указанной буферной смеси и последующем настаивании полученного гомогената в темноте при 20°С в течение 24 ч, Затем гомогенат центрифугировали при 1000 в течейие 3 мин. Осадок после центрифугирования отбрасывался,а надосадочная жидкость отфильтровывалась. Фильтрат подвергался спектральному исследованию и характеризовался отсутствием полос поглощения в области 400-750 нм, что указывает на отсутствие в нем хлорофилла.

Предлагаемый способ по сравнению с известными дает возможность длительно защищать от фотодеструкции хлорофиллсодержащие фотосинтетические мембраны, функционирующие в режиме фотобиохимического процесса. Отпадает необходимость в использовании дорогостоящих соединений, таких как альбумин, аскорбат натрия, глутаровый альдегид. В качестве защитного агента используется буферный экстракт из листьев широко распространенного дикорастущего древовидного кустарника Danae racemosa (Asparagaceae) или Ruscus hypophyllum. Получение этих экстрактов легко осуществимо и требует минимальных затрат.

«N «vj

.H

СПОСОБ ПРЕДОХРАНЕНИЯ ХПОРО«ШЛПА В ИЗОЛИРОВАННЫХ МЕМБРАНАХ ОТ ФОТОДЕСТРУКЦИИ путем введения стабилизатора, отличающийся тем, что, с целью увеличения сроков сохранения хлорофилла в мембранах и упрощения процесса, в качестве стабилизатора используют экстракт из листьев Danae racembsa, взятьй в 800-3000-кратном избытке по отнощению к содержанию хлорофилла.