СПОСОБ СОХРАНЕНИЯ ЖИЗНЕСПОСОБНЫХ ЛЕЙКОЦИТОВ КРОВИ Российский патент 2006 года по МПК C12N5/02 

Изобретение относится к биологии, а именно к разделу иммунологии, и может быть использовано для хемилюминесцентного анализа в медицине и ветеринарии.

Известен «Стабилизирующий состав для получения лиофилизированных препаратов на основе культурального вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей», авторское свидетельство №1761800 А1, С 12 N 7/00, А 61 К 39/125 от 15.09.92. Бюл. №34. Для получения сухих вирусных препаратов используют стабилизирующий состав, который содержит (г/л культуральной вирусной суспензии): мальтоза 28-60; пептон 44-100; желатин 10-20; бычий сывороточный альбумин 11-25, тиосульфат натрия 1,25-3,0.

Однако предложенный стабилизирующий состав можно использовать только после лиофилизации вирусного материала, что требует дорогостоящего оборудования.

Из описанных в литературе наиболее близким к изобретению является «Способ сохранения иммунокомпетентных клеток путем культивирования их в питательной среде», авторское свидетельство №1073281, С 12 N 5/00, G 01 N 54/57 от 15.02.84. Бюл. №6.

Способ осуществляют путем выделения иммунокомпетентных клеток или гомогената тканей органов наслаиванием на стандартный градиент плотности фиколл-верографина, выделенные клетки трижды отмывают от фиколла и верографина средой 199. Затем полученные лимфоциты помещают в стеклянные емкости с предварительно охлажденной до 5-15°С питательной средой 199, дополнительно содержащей желеобразующие компоненты, фиксирующие при понижении температуры иммунокомпетентные клетки во взвешенном состоянии, а также инактивированную сыворотку I группы крови человека, 1%-ный раствор 1-глутамина и 2% раствор L-аспарагина. Емкости с культуральной средой и клетками ставят в бытовой холодильник и время от времени периодически встряхивают до момента перехода культуральной среды из жидкого состояния в желеобразное с последующим визуальным контролем равномерного распределения клеток.

Однако предложенный метод позволяет выделить только один тип «белых» клеток - лимфоциты, осуществлять визуальный (субъективный) контроль равномерного распределения клеток, кроме того, метод дорогостоящий.

Важную роль при бактериальных инфекциях во взаимодействии иммунокомпетентных клеток играют фагоциты (нейтрофилы и др.), которые перерабатывают антиген (микроб, чужеродная клетка), переводя его в более иммуногенную форму и участвуя тем самым в специфической сенсибилизации соответствующих лимфоидных элементов гуморальной и клеточной систем (Я.Е.Коляков, 1986).

Задачей изобретения является повышение срока сохранения жизнеспособных лейкоцитов крови и предотвращения их склеивания при проведении хемилюминесцентного анализа.

Способ осуществляют следующим образом. Предварительно производят забор крови с трилоном Б в пробирки, обработанные 3% раствором полиметилсилоксановой жидкости в хлороформе. Разрушение эритроцитов осуществляют путем гипотонического лизиса. Центрифугируют при 1200 об/мин в течение 15 мин. Дополнительно лейкоциты отмывают 0,02% раствором натриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (трилон Б). Центрифугируют при вышеуказанном режиме, надосадочную жидкость сливают. Осадок суспензии клеток ресуспендируют в стабилизирующем растворе следующего состава: концентрат Хэнкса без фенолового красного в соотношении с водой 1:9.

Коцентрат Хэнкса без фенолового красного, используемый для исследований, выпускается промышленным способом Предприятием по производству бактерийных препаратов Свердловского НИИ вирусных инфекций, состоит из концентрированного раствора А, содержащего хлорид натрия, хлорид калия, сульфат магния, хлорид кальция, хлороформ для консервации, бидистиллированную воду; концентрированного раствора Б, содержащем двузамещенный фосфорнокислый натрий, однозамещенный фосфорнокислый калий, глюкозу, бидистиллированную воду; раствора В, содержащего карбонат натрия.

При перемешивании на магнитной мешалке к 100 мл концентрата Хэнкса без фенолового красного в соотношении с водой 1:9 добавляют 10-15 мг глюкозы до полного растворения, затем раствор подогревают до 50°С и добавляют 10-15 мг бычьего сывороточного альбумина лиофилизированного до получения однородного коллоидного раствора. Полученный раствор фильтруют, фасуют, хранят в морозильной камере при -20°С до 1 мес.

Стандартный концентрат Хэнкса без фенолового красного в соотношении с водой 1:9 в качестве буфера обеспечивает благоприятную среду для лейкоцитов, обладает способностью поддерживать рН (водородный показатель) и изотоничность на одном уровне. Предлагаем использовать концентрат Хэнкса без фенолового красного, т.к. фенольные соединения гасят хемилюминесцентное свечение (Nelson et al., 1977).

Дополнительное отмывание лейкоцитов стандартным раствором трилона Б, который представляет 0,02% раствор натриевой соли этилендиаминотетрауксусной кислоты в бидистиллированной воде, обеспечивает получение однородной взвеси клеток, т.к. в основе действия этого стандартного раствора лежит способность связывать комплексы, содержащие кальций. В результате связывания ионов кальция и магния межклеточные связи ослабевают и тогда с помощью слабого механического воздействия можно получить однородную взвесь клеток (З.Лярски, 1980).

Силикон, или кремнийорганические соединения, характеризуется низкой температурой застывания, гидрофобностью, химической инертностью, высокой термической и термоокислительной стабильностью, относительно малым измененением вязкости с изменением температуры, хорошими диэлектрическими свойствами, что предотвращает прилипание форменных элементов крови к стенкам пробирки, этим самым увеличивает выход лейкоцитов.

Альбумин - поддерживает коллоидно-осмотическое (онкотическое) давление, а также рН крови. Комплексы альбуминов легко диссоциируют при изменении рН, ионной силы или при наличии в тканях какого-либо компонента, образуют более прочные связи с ингредиентами комплекса (БМЭ, т.1. С.906).

В концентрат Хэнкса без фенолового красного в соотношении с водой 1:9 добавляют альбумин, перемешивают, для растворения альбумина смесь подогревают до 50°С, получая однородный коллоидный раствор. Повышение температуры нарушает третичную структуру альбумина, определяющую его специфичность (П.Зенгбуш, 1982).

Глюкоза - создает осмотическое давление, предохраняет выделенные микроструктуры от разрушения (Л.М.Модель, 1962).

Пример 1. Рабочий раствор готовят из стандартного 10-кратного концентрата Хэнкса без фенолового красного в качестве буферного раствора, который имеет рН 7,4-7,6. Состав Хэнкса составлен таким образом, что он уравновешивается воздухом, а не СО² (В.Лярски, 1980). Ниже приводим таблицу подбора разведений концентрата Хэнкса и дистиллированной воды.

Таблица 1
Сохранение жизнеспособных лейкоцитов при различных соотношениях концентрата Хэнкса и водыВариантСохранение жизнеспособных лейкоцитов (%)10-кр. концентрат Хэнкса30-401 ч. концентрата Хэнкса + 1 ч. дистиллированной воды60-701 ч. концентрата Хэнкса + 9 ч. дистиллированной воды90-95

Из таблицы 1 видно, что разведение 1 ч. концентрата Хэнкса + 9 ч. дистиллированной воды обеспечивает наибольшее сохранение жизнеспособных лейкоцитов.

Пример 2. Приводим сравнительную оценку сохранения жизнеспособных лейкоцитов в жидких питательных средах, используемых для стабилизирующих растворов.

Таблица 2ВариантыСохранение жизнеспособных лейкоцитов (%)Среда 19990-951 ч. концентрата Хэнкса без фенолового красного + 9 ч. дистиллированной воды90-95

Из таблицы 2 видно, что обе среды имеют большой процент сохранения жизнеспособных лейкоцитов, однако среда 199 содержит фенол, который гасит хемилюминесцентное свечение, поэтому для проведения хемилюминесцентного анализа предлагаем концентрат Хэнкса без фенолового красного в соотношении с водой 1:9.

Пример 3. Приводим сравнительную оценку сохранности жизнеспособных лейкоцитов при добавлении различных доз глюкозы и альбумина в стабилизирующий раствор

Таблица 3
Сохранение жизнеспособных лейкоцитов в зависимости от дозы глюкозы и альбуминаВариант В 100 мл (1 ч. концентрата Хэнкса + 9 ч. воды)Сохранение жизнеспособных лейкоцитов (%)1-5 мг глюкозы
1-5 мг альбумина70-7510-15 мг глюкозы
10-15 мг альбумина90-95

Из таблицы 3 видно, что добавление глюкозы и альбумина сывороточного в дозе 10-15 мг обеспечивает наибольший выход жизнеспособных лейкоцитов.

В камере Горяева 1% трипановым синим определяют жизнеспособность лейкоцитов, при этом живых клеток должно быть не менее 90-95% в концентрации 2×10⁶ кл/мл.

Предлагаемый способ позволяет сохранить постоянство параметров клетки: химический состав среды, температуру, кислотность, осмотическое давление. Благодаря проницаемости мембран для воды концентрация растворенных веществ внутри и снаружи клетки не приводит к возникновению градиента гидростатического давления на мембране: за счет изменения объема клетки он сохраняется равным нулю. В то же время биомембраны обладают высокой стереоспецифичностью: через них проникают только Д-изомеры Сахаров и L-аминокислоты (Я.Кагава, 1985).

Таким образом, вся совокупность существенных признаков повышает срок сохранения жизнеспособных лейкоцитов (90-95%), что на 20-25% выше по сравнению с известными способами при проведения хемилюминесцентного анализа.

Изобретение относится к биологии, а именно к иммунологии. Способ включает получение стабилизирующего раствора для максимального сохранения выделенных жизнеспособных лейкоцитов и предотвращения их склеивания. Далее проводят забор крови, выделяют лейкоциты с помощью концентрата Хэнкса без фенолового красного, который используют в соотношении с водой 1:9, дополнительно содержащий глюкозу, лиофилизированный бычий сывороточный альбумин в дозе 10-15 мг на 100 мл каждого. Способ позволяет сохранить постоянство параметров клетки и повысить срок сохранения жизнеспособных лейкоцитов (90-95%) при проведении хемилюминесцентного анализа. 3 табл.

Способ сохранения жизнеспособных лейкоцитов в стабилизирующем растворе, включающий забор крови, выделение лейкоцитов крови с помощью концентрата Хэнкса без фенолового красного, отличающийся тем, что концентрат Хэнкса без фенолового красного используют в соотношении с водой 1:9, который дополнительно содержит глюкозу и бычий сывороточный альбумин в дозе 10-15 мг на 100 мл.