Способ выделения микроорганизмов из суспензий Советский патент 1984 года по МПК C12N7/00 

1 Изобретение относится к микробио логии и вирусологии и касается вьделения микроорганизмов из суспензий. Известен способ разделения биологических суспензий с помощью процессов фильтрации через пористые мембра ны , 3. Однако пористая мембрана закупори вается крупными частицам I, задерживает фильтрацию мелких частиц, что снижает производительность этого способа. Известен также способ выделения микроорганизмов из суспензий путем пропускания исследуемого материала НаД мембраной, сорбции и последующей десорбции микроорганизмов .23. Однако известный способ не обеспе чивает высокой сохранности биологической активности целевого продукта Целью изобретения является повышение сохранности биологической активности целевого продукта. Поставленная цель достигается тем что согласно способу выделения микро организмов из суспензий путем пропус кания исследуемого материала над мем раной, сорбции и последующей десорбции микроорганизмов, суспензию пропускают над поверхностью мембраны со скоростью тангенциального потока 0,1 20 см/с при перепаде давления на мембране 0,01-1,0 мПа, после сорбции микроорганизмов жидкую фазу удаляют и микроорганизмы десорбирукгг с помощью тангенциального потока буферного раствора при скорости 20-200 см/с и отсутствии перепада давления на мемб ране или периодической подачи на мембрану импульсов отрицательного давления длительностью 0,01-100 с с интервалом между импульсами 0,1100 с. Кроме того, с целью ускорения десорбции, поток буферного раствора барботируют. Способ осуществляют следующим образом. Биологическую суспензию (БС) пропускают над обычными мембранами со скоростью тангенциального потока (вдоль поверхности мембраны) 0,120 см/с и перепаде давления на мембрайе 0,01-1 мПа за счет гидродинамических сил, обусловленных потоком через поры, крупный компонент удержи вается на поверхности мембраны, в то время как мелкий компонент частич но фштьтруется через поры и частично 331 уносится тангенциальным потоком. Для полноты осаждения крупного компонента раствор, прошедший через фильтрующий аппарат, рециркулируют (возвращается в исходную емкость) в течение 1-3 ч. После завершения процесса посадки часть раствора, содержащую мелкий компонент, сливают, а частицы крупного компонента десорбируют буфером с рН в пределах 6,5-7,5. Для этого поток фильтрата перекрывают, тем самым прекращается действие давления жидкости на крупный компонент БС. Для полноты смыва скорость тангенциального потока буфера увеличивают до 20-200 см/с. Время элюции 1030 мин. Проведенные эксперименты показали, что более эффективная посадка крупного компонента достигается при предварительной очистке исходной БС на фильтре Петрянова, а смыв этого компонента облегчается при применении барабана (введение в буфер пузырьков газа - азот, воздух). Обнаружено также, что повышение скорости фильтрации и прохождения мелкого компонента в фильтрат достигаются в том случае, если на мембрану подается не постоянный, а пульсирующий перепад давления. Оптимальные результаты достигаются при длительности действия импульсов 0,1-100 с и промежутков между импульсами 0,1-100 с. Импульсы давления могут подаваться как в направлеНИИ фильтрации, так и обратно ему. Пример 1. Фильтрация производится по схеме, в которой используется фильтрационный модуль типа фильтрпресс с рабочей поверхностью 3760 Модуль укомплектован ацетатцеллюлозными мембранами со средним радиусом пор 1000 А (мембраны Биопор производства ВНИИОЧБ). В качестве БС используется вируссодержащая аллантоисная жидкость (ВЛЖ) с вирусом А (Техас) . Скорость тангенциального потока ф iльтpyeмoй жидкости на стадии посадки 20 см/с, Др 1 МПа. Смыв вирусных частиц после посадки на мембраны осуществляется 0,5 М трис-буфером, рН 7,2 при скорости потока буферного раствора 200 см/с. Процесс посадки вируса проводится в течение 3ч. Исходный объем ВАЖ 4000 мл. Титр РГА/0,2 исходной ВАЖ 1:1024, содержание белков 2000 мкг/мл (по Лоури). Конечный объем ко цьнтрата (после осадки и смыва буферным раствором.

3.

время смыва 30 мин) 400 мл, титр РГА/0,2 концентрата 1:16000, содержание белков 2000 мкг/мл. Сохранение активности вируса (в процентах к исходной ВАЖ) 100%. Увеличение удельной активности (по отношению к исходной ВАЖ) 10 раз.

Пример 1а. Приборное оформление опыта такое же, как и в примере 1.

Фильтрационный модуль укомплектован мембранами Биопор со средним радиусом пор 1000 А. Биологическая суспензия - вирус Ньюкасловской болезни (ВНБ). Исходная активность А 7,5 1/мл. Исходный объем БС 5000 мл. Посадка проводится в течение 2,5 ч при скорости тангенциального потока БС 0,07 см/с, йр 0,01 МПа. Смыв вируса после посадки на мембране осуществляется 0,05 М трис-буфером рН 7,5, при скорости 20 см/с. Конечный объем концентрата (после посад ки и смыва) 490 мл. А концентрата 35 1/мл, А фильтрата 40 1/мл. Электронная микроскопия показывает наличие большого количества вирусных частиц в фильтрате. Сохранение активности вируса 47%.

Пример 2. Приборное оформление опыта такое же, как и в примере 1

Фильтрационный модуль укомплектовывается мембранами Биопор со средним радиусом пор 2000 А. Биологическая суспензия Serracia marcescens штамм В-10, М-1, число клеток 3-10 1/мл, активность по ферменту (эндонуклеазе) 2000 1/мл (эндонуклеазная активность А определяется методом Мак-Карти). Посадка проводится в течение 3,5 ч при скорости тангенциального потока фильтруемой жидкости 100 см/с, Лр МПа. Скорость смыва клеток после посадки на мембрану 200 см/с при рН 6,5. Исходный объем БС 4000 мл. В обесклеточенной жидкости А 2000 1/мл, а электронная микроскопия показывает практически полное отсутствие клеток. Сохранение эндонуклеазной активности 100%.

Пример 3. Приборное оформление опыта такое же, как и в примере 1.

Фильтрационный модуль укомплектовывается мембранами Биопор со средним радиусом пор 1000 А. Биологическая суспензия - вирус Пьюкасловской болезни (ВНБ). Исходная активность А 7,5 1/мл (А определяется по мак068334

симальному разведению при кратности 1:10, обеспечивающей 50% - гибель 10-ти дневных куриных эмбрионов). Исходный объем БС 3500 мл, Посад5 ка проводится в течение 3 ч при скорости тангенциального потока БС 0,1 см/с, dp 0,01 Ша. Смыв вируса после посадки на мембране осуществляется 0,05 М трис-буфером, рН 7,5,

0 при скорости 20,0 см/с. Конечньй объем концентрата (после посадки и смыва) 400 мл, А концентрата 70 1/мл, А фильтрата 1 1/мл. Электронная микроскопия показывает отсутствие вируса

5 в фильтрате. Сохранение активности вируса 100%.

П р и М е р 4. Приборное оформление опыта и тип БС такой же, как и в примере 1. Начальный объем БС

0 4000 мл, фильтруется через слой фильтра Петрянова со средним размером пор 1-10 мкм. Титр-РГА после такой предфильтрации полностью сохраняется, содержание белков сохра-

5 няется. Время посадки 2,5 ч. Содержание белка в концентрате (после посадки и смыва буфером - условия опыта такие же, так и в примере 1) 2000 мкг/мл, титр РГА/0,2 концентра0 та 1:16000. Сохранение активности вируса 100%.

Пример 4а. Приборное оформление опыта, мембраны и тип БС такой - же, как и в примере 1а. Начальный

5 объем БС 5000 мл. Исходная активность А 7 1/мл. Посадка проводится в течение 2 ч при скорости тангенциаль.ного потока БС 22 см/с, dp 0,01 МПа . Смыв вируса после посадки на мембраны

0 осуществляется 0,05 М трис-буфером, рЯ 7,5, при скорости 20 см/с. Конечный объем концентрата (после посадки и смыва 500 мл. А концентрата 40 1/мл, А фильтрата 30 1/мл.

5 Электронная микроскопия показывает наличие большого количества вирусных частиц в фильтрате. Сохранение активности вируса 57%.

Пример 5. Приборное оформле5Q ние опыта и биологическая суспензия такая же, как в примере 1. Однако в линию фильтрат подключается перистальтический насос с одним роликом. Направление вращения - навстречу потосе ку фильтрата. В результате периодически (половина времени полного оборота) создается давление в зоне фильтрата, превьшгающее давление над фильтрующей мембраной м, как следствие, поток из

зоны фильтрата проходит сквозь мембрану в зону концентрата.

Таким образом, решаются две задачи - очистка пор мембран от примесных частиц (белков) и облегчается смыв крупнодисперсных частиц (вируса) с поверхности мембраны. Программное устройство, управляющее работой насоса, позволяет осуществить время действия импульсов давления в диапазоне 0,1-100 с и периодичность следования импульсов 0,1-100 с.

Результаты концентрирования такие же,.как и в примере 1. Однако, если в примере 1 проницаемость по воде мембраны в фильтрующем аппарате падае от опыта к опыту в 1,5-2 раза от предьщущей, то в этом случае она практически остается неизменной.

Сохранение активности вируса 100%.

Пример 6. Приборное оформление, тип БС и условия опыта такие же.

как и в примере 1, только в процессе смыва буферный раствор перемешивается с пузырьками газа (воздух, азот) в объемном соотношении 50%.

Время смыва 10 мин. Титр РГА/0,2 концентрата 1:16000, содержание белков 2000 мкг/мл. Выход по РГА (в процентах к исходному ВАЖ) 100%. Увеличение удельной активности (по отношению к исходной ВАЖ) 10 раз. Сохранение активности вируса 100%.

Предлагаемый способ очистки концентрирования позволяет сохранить 100% биологической активности выделяемых частиц при степенях концентрирования до 20-25 раз при отсутствии концентрирования белка, работать при использовании широкого класса мембран, диамет пор которых подбирается исходя из условия полного задержания крупнодисперсных частиц.

1. СПОСОБ ВЬЩЕЛЕНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ ИЗ СУСПЕНЗИЙ путем пропускания исследуемого материала над мембраной, сорбции и последующей десорбции микроорганизмов, отличающийс я тем, что, с целью повьппения сохранности биологической активности целевого продукта, суспензию пропускают над поверхностью мембраны со скоростью тангенциального потока 0,120 см/с при перепаде давления на мембране 0,01-1,0 мПа, после сорбции микроорганизмов жидкую фазу удаляют и микроорганизмы десорбируют с помощью тангенциального потока буферного раствора при скорости 20-200 см/с и отсутствии перепада давления на мембране или периодической подачи на мембрану импульсов отрицательного давле(Л ния длительностью 0,01-100 с с интервалом между импульсами 0,1-100 с. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что, с целью ускорения десорбции, поток буферного раствора барботируют.