Способ калибровки ультрафильтрационных мембран Советский патент 1983 года по МПК C12Q1/00 C12N9/00 

Nl

&0

.iu Изобретение относится к области разделения веществ, а именно к способам калибровки ультрафильтрационных мембран. Известно использование для калиб ровки мембран электронной микроско пии иртутной порометрии 13. Недостатком этих способов являет ся сложное аппаратурное оформление и трудоемкость. Кроме того, способ электронной микроскопии недостаточно эффективен в случае калибровки ультрафильтрационных мембран с малым размером пор, а ртутная поромет рия требует высоких давлений, что обычно приводит к деформации мембран. Наиболее близок к .предложенному способ калибровки ультрафильтрацион н,ых мембран пропусканием через них растворов веществ с определенными м лекулярными массами, последующим анализом фильтрата и концентрата, м тематической обработкой результатов и калибровочных кривых. Каждый понент фильтруется в виде раствора, после чего измеряется концентрация вещества в фильтрате(Сф) и ко центрате (С) и определяется коэффициент задержания ( Ч ) по формуле Результаты, полученные по отдельным веществам с массой М, отражаются в виде кривой зависимости Чот igM В качестве калибровочньзх веществ для калибровки обычно используют фракции водорастворимых полимеров - декстраг нов, полиэтиленгликолей, а также гло булярные белки С2 7 . Недостатком способа является необходимость использования чистых веществ, так как наличие примесей вносит существенную ошибку в результаты калибоовки. Кроме того, способ калибровки весьма трудоемок(25 дней). Цель изобретения - повышение точности калибровки и снижение ее тру.доемкости. Поставленная цель достигается тем что согласно способу калибровки ульт рафильтрационных мембран пропускание через них растворов ветпеств с изтчест нымй молекулярными массами,последующ анал-изоМ фильтрата и концентрата, ма тематической обработкой результатов и построением калибровочных кривых, в качестве калибоозочного раствора используют смесь, содержащую твиптофан,бацитрацин, цитохрок С, химотрипсиноген, яичный и бычий сывороточный альбумин и jp-глобулин в 6,1 н.фосфатном буфере при рН 6,6, а анализ осуществляют с помощью гель хроматографии на колонке, наполненной ультрагелем АсА-54, при скороети элюции тем же фосфатным буфером 46 мл/час. Используют смесь, сод1ржащую 0,05 мг/мл триптофана и указанные компоHelHTH. в одинаковых количествах, равных 0,5 мг/мл. Калибровка проводится следующим образом. Смесь для калибровки фильтруют через мембрану. После того, как профильтруется 15-20% от исходного объема ( 4 мл), отбирают пробы { 0,5 мл) фильтрата и концентрата и анализируют концентрации находящихся в них понентов методом гель-фильтрации на колонке, содержащей гель АсА-54 при скорости элюции фосфатньгм буфером .4-6 мл/ч. По концентрациям компонентов в фильтрате и концентрате по формуле (1) рассчитывают коэффициент задержания V. Выбор экспериментальных условий разделения обусловлен параметрами, при которых достигается полное разделение найденной смеси. Так, изменение диапазона рН 6,6+0,2, в котором определяется точность рН при разделении за указанные пределы, приводит к резкому ухудшению разделения компонентов, что связано с их агрегацией и взаимодействием. Также при скоростях меньших 4 мл/ч происходит сильное диффузное размывание, а при скоростях более 6 мл/ч разделение ухудшается за счет неравновесности процесса. Применение геля АсА-54 по сравнению с другими ультрагелями (АсА-34; АсА-22) позволяет получить желаемые результаты. Так, на геле АсА-34 не делятся бацитрацин и цитохром, на АсА-22 - бацитрацин, цитохром, химотрипсиноген и т.д. На фиг. 1 приведены обобщенные данные для разных мембран, полученные калибровкой по«смесям (А) и калибровкой по индивидуальным веmecTBaMv- (Б), Зависимости пред-- . ставлены в приведенных координатах Ч от Z , где Ч- коэффициент задержа Э .д ния 7-Средняя мо+ у, Ww лекулярная масса задержания,dдисперсия кривой задержания. Среднеквадратичные погрещности определения кривой задержания, найденные по этим данным составляют: в случае калибровки по смесям - 5%, при калибровке по индивидуальным веществам - 12%. Калибровка по смесям дает также более плавные кривые зависимости Ч (М), которые-наиболее адекватно отражают распределение пор по размерам, обнаруженное другими методами. В результате замены калибровки по индивидуальным веществам на калибровку по смеси время, затрачивае мое на калибровку, снижается с 3 до 0,5 дня. Это достигается заменой серии ультрафильтрационных опытов со спектрометрическим определением концентраций и предварительным подбором образцов мембран (5-7) с р ной проницаемостью на единичный ультрафильтрационный опыт. Таким образом, при применении данного метода резко сокращается объем трудозатрат на калибровку мембран, достигается строгое единообразие условий фильтрации для всех компонентов смеси, условия фильтрации оказываются более близкими к условиям разделения реальных смесей, что повышает точность .кривой задержания в результате приближения условий калибровки к условиям реальных процессов. Кроме того, смесь может быть многократно использована. Способ может быть применен для калибровки неочищенных белков. - . , Пример 1.15 мл модельной смеси, содержащей; мг/л;раствор триптофана ,05, бацитрацин цитохром С 0,5, химотрипсиноген 0,5, яичный 0,5 и бычий сывороточный. 0,5 мг/мл альбумины, у-глобулин 0,5, -.фильтруют ультрафильтрационную мембрану УА1Л-150 производ .ва Владимирского ВНИИСС и мембрану Виопор А-2 производства. ВНИИособо чистых биопрепаратов. После пропуск ния 4 мл было отбирают по 0,4 мл фильтрата и концентрата, которые . анализируют на колонке размером 0,9 60 см, наполненной ультрагелем АсАпри скорости элюций фосфатным буфером 5 МП/ч (фиг. 2). По гель-хроматограммам расчитывают концентрации в фильтрате и концентрате отдельных компонентов смеси и строят кривые задержания указанных мембран фиг.2 светлые кружки). Для сравнения эти мембраны калибруют индивидуальными компонентами смеси (фиг.2, темные кружки). Как следует из сопоставле ния .данных, калибровка по смесям, дает более плавные кривые с меньши разбросом экспериментальных точек. зменение скорости элюций до значения меньших 4 мл/ч и больших 6 мл/ч приводит к ухудшению разделения веества. Пример 2. Для концентрирования и очистки от низкомолекулярных примесей промышленного препарата - амилоризина, содержащего целевые ферменты с молекулярными массами 43 тыс, используется мембрана Биопор Т-10, прокалиброванная по смеси. По данным калибровки абсоч лютный предел задержания равен 40 тыс.дальтон. Опыты по концентрированию амилоризина на мембране Виопор Т-Ю со степенями концентрирования до 25 раз свидетельствуют о полном его задержании, В то же время низкомолекулярные примеси фильтруются с коэффициентом задержания 0,6., что соответствует рассчитанному для них по кривой задержания.мембранн. т-10 коэффициенту задержания . . (0,6Ч;0,05) . Коэффициент задержания, найденный по кривой, построенной по индивидуальным веществам,О,54±0,09. Сопоставление этих данных показывает, что использование описанного способа позволяет получить, более точные величины. Кроме того, использование этого способа позволяет, исходя из молекулйрно-массового состава образца и кривой задержания, определенной по смеси, . под.сказать результаты очистки. Так, в частности, гель-хроматографичёский анализ амилоризина позволяет определить молекулярную массу при месей, найти их коэффициент задержания для мембраны Т-10 и рассчитать степень очистки (при концентрировании в 25 раз расчетная степень очистки составляет 3,6, Эк©периментальная - 3,9). Таким образом, использование и обретений позволяет упрости-ть технологию калибровки ультрафильтрацконных мембран и повысить ее точность, а также предсказать результаты очистки смесей веществ на основании более точной калибровйи Meiii6paH. Изобретение может найти широкое применение в npoi eccax, связанных с использованием ультрафипьтрациониого .оборудования.

1. СПОСОБ КАЛИБРОВКИ УЛЬТРА. ФИЛЬТРАЦИОННЫХ ВШМБРАН пропусканием через них растворов веществ с опрё/деленными молекулярными массами, последующим анёшизом фильтра и кон- i центрата, математичер1шй обработкой результатов и построением калибровочных кривых, о т л « ч а ю ia и йс я тем, что, с цепью повышения точности калибровки и снижения ее трудоемкости, в качестве калибровочного раствора используют смесь, содержащую триптофан, бацитрацин, цитохром С, химотрйпснноген, яичный и бычий сывороточный аль($умин и ярглобулин в 0,1 н.фосфатном буфере при рН 6,6, а анализ осуществляют с помощью гель-хроматографии на колонке, наполненной ультрагелем АсАе54, при скорости 9ЛЮЩ1И.ТеМ же фосфатным буфером 4-6 мл/ч. 2. Способ по п. 1, о т л к ч аю щ и и с я тем, что используют смесь, содержащую 0,05.мг/мл триптофана и остальные указанные компоненты в одинаковых количествах,равных 0,5 мг/мп.