Способ получения иммуногенных гликопротеинов вируса гриппа Советский патент 1984 года по МПК A61K39/145 

00 ел

оо 11 Изобретение относится к микробио логической промьпапенности, преимущественно к технологии получения противогриппозной вакцины и касается получения иммунргенных субъединиц вируса гриппа - нeйтpa шни-: дазы и гемагглютинина. Известные способы получения имму ногенных гликопротеинов вируса грип па путем обработки вируса неионным детергентом fl . Однако известные способы не позволяют получить высокий выход целевого продукта и предусматривают применение сложного и дорогостоящего оборудования. Известен способ получения иммуно генных гликопротеинов вируса гриппа путем обработки очищенного концентрата вируса катионным детергентом цетилпиридинийхлоридом, отделения полученньпс гликопротеинов и удалени из раствора катяонного детергента а Известный способ является сложны и длительным при исполнении, поскол ку применяется высокоскоростное центрифугирование и длительная процедура удаления детергента в процес се диализа. Цель изобретения - упрощение спо соба.. Указанная цель достигается тем,ч согласно способу получения иммуногенных гликопротеинов вируса гриппа путем обработки очищенного концентрата вируса катионным детергентом - цетилпиридинийхлоридом, отделения полученных гликопротеинов и удаления из раствора катионного детергента тем, обработку концентра та проводят при массовом соотношении детергента к белку вирусного коицент;рата, равном 1,0:1-1,5:1, а отделение детергента осуществляют при температуре . . Способ вьтолияется следующим образом. В суспензию вируса гриппа в фосфатно-солевом буфере с концентрацие по белку 0,4-1,2 мг/мл добавляют при перемешивании при комнатной температуре раствор цетилпиридинийхлорида (1/50-1/120 от исходного объема суспензии вируса) так, чтобы конечное весовое соотношение катион ный детергент - белок было 1:11,5:1. После перемешивания в течение 1 ч при комнатной температуре смесь центрифугируют при 6000 g в течение 10 мин при комнатной температуре или пропускают под избыточным давлением 1,0-0,3 атм через мембрану с диаметром пор 52±2 нм цлн 420±20 нм, супернатант или фильтрат охлаждают при 1-4°С в течение 16 ч и раствор гликопротеинов отделяют от осадка детергента при центрифугированием при 15000 g в течение 15 мин, или декантацией, или микрофильтрацией через фильтр с диаметром пор 420 ±20 нм. Работу проводят в асептических условиях, а в случае необходимости стерилизацию растйора гликопротеинов осуществляют пропусканием через каскад фильтров с диаметром пор 0,8-1,4 мкм и 0,22 мкм. Определение остаточного количества детергента в растворе гликопротеинов проводят быстро и с высокой чувствительностью по разности оптических плотностей при 260 и 280 нм в отличие от обычно применяемых менее чувствительных цветных реакций. В табл. 2 приведены данные выделения гликопротеинов сочетанием ультрафильтрации и декантации или «икрофильтрации и деканта1Ц1и. Пример 1. Получение гликопротеинов вируса гриппа сочетанием ультра- и микрофильтрации. В 40 МП взвеси концентрированного и очищенного вируса гриппа штамм А,/Ленинград/385/80 (H3N2) в 0,01 М натрий-фосфатном буфере с 0,15 М хлористого натрия рН 7,2j титр вируса в РГА 1:16384, весовое содержание гемагглютинина в реакции одиночной радиальной иммунодиффузии (ОРИД) 200 мкг/мл, общее содержание белка 430 нкг/мл, добавляют при перемешивании 0,34 МП 5%-ного водного раствора цетилпиридинийхлорида ( соотношение катионный детер гент:белок равно 1:1) и перемешивают в течение 1 ч пр|И комнатной температуре. Смесь пропускают при 22С со скоростью 0,7 МП/мин под давлением 0,4 атм через полиядерную мембрану (эффективная поверхность 12,5 см) с диаметром пор 5212 нм, мембрану промывают 10 МП 0,01 М фосфатно-солевого буфера рН 7j2.Ультрафильтрат (50 МП, 300 мкг/мл белка, 130 мкг/мл гемагглютинина, титр РГА 1:2048) охлаждают при в течение 16 ч, выпавший осадок детергента отделяют микрофнльТрацией при 3°С со скоростью 200 мп/ч под избыточньай давлением 0,3 атм через полиядерный фильтр (эффективная поверхность 3,6 см) с диаметром пор им. Полученный раствор гликопротеино (49 мл) содержит в 1 мл 246 мкг белка (70% от содержания в очищенном концентрате вируса), 117 мкг/мл гемагглютинина (71%), 30 мкг цетилп ридинийхлорида, имеет титр РГА 1:8192 и имеет 80% нейраминидазной активности. Наличие и чистота гемагглютинина и нейраминидаэы в растворе гликопротеинов подтверлдены данными электронной микроскопии электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия - никаких примесных компонентов этими методами выявить не удалось. При разведении до 15 мкг гемагглютинина в дозе (0,5 кп) препарат оказался безвредным и апирогенным для животных: при проверке иммуногенности на крысах среднегеометрический титр сьшоротки в реакции подавления гемагглютинина составил 508±23 после двухкратного вне дения с интервалом 28t3 дня. Аналогичным образом получен раст вор гликопротеинов вируса гриппа из штамма А./ мев/59/79. В табл. 1 приведены выходы гликопротеинов вируса гриппа А /Киез/5 /79 при их выделении сочетанием ультра и микрофильтраций. Пример 2. Получение гликопротеинов вируса гриппа ультрафильт рацией с последующей декантацией, от пример отличается от примера 1 feM, что отделение.гликопротеинов проводят на мембране PSVP (Мйллипор США) вместо полиядерной мембраны 50 нм (г.Дубна), а отделение осадка детергента, выпавшего при охпазщении (, 16 ч) осуществляют декан тацией. В полученном растворе гликопротеинов (50 мл, табл.2) по данн электрофореза в полиакриламидном ге в присутствии додецилсульфата натри обнаружены только гемагглютинин и нейраминидаза. Пример 3. Получение гликопротеинов вируса гриппа микрофильтрацией с последующей декантацией. Этот пример отличается от примера 1 тем, что после обработки очищенного концентрата вируса гриппа А /Киев/59/79 H1N1 5%-ным водным раствором.цетилпиркдинийхлорида (0,23 мл, соотношение детергент:белок равно 1,5:1) при 18С,смесь пропускают со скоростью 200 мл/ч под избыточным давлением 0,3 атм через полиядерный фильтр (эффективная поверхность 3,6 см) с диаметром пор 420i20 HMi фильтрат дополнительно промывают 10 мл 0,01 М фосфатно-солевого буфера с рН 7,2. Дальнейшую обработку фильтрата после охлаждения (, 16 ч) проводят, как описано в примере 2 (табл.2). Степень чистоты полученного раствора гликопротеинов по данным электрофореза в полиакриламидном геле аналогична описанные в примерах 1 и 2. При мер. 4. Получение гликопротеинов вируса гриппа А,/Ленинград/ /385/80 низкоскоростным центрифугированием. . К 41 мл очищенного концентрата вируса гриппа Aj/Ленинград/385/80 (H3N2), содержащего в 1 мл 1270 мкг белка, 599 мкг гемагглютинина, с титром РГА 1:10240, добавляют 1,04 мл 5%-ного водного раствора цетилпиридинийхлорида (соотношение детергент:белок равно 1:1), перемепивают в течение 1 ч при 20С и центрифугируют при 6000 g в течение 10 мин. Супернатднт (41 мл, белок - 1020 мкг/мл, 80 %;гемагглютинин - 470 мкг/мл, 78%j РГА 1:8192, нейраминидазная активность - 75% от исходного) охлаждают при в течение 16 ч и центрифугируют при 4°С в течение 15 мин при 15000 - g. Супернатакт (41 мл, белок 890 мкг/мл, 70%; гемагглютинин 424 мкг/мл, 71%i РГА - 1:10240, нейраминидазная активность - 72%, цетилпирцдинийхлорид - 0,004%) стерилизуют пропусканием через мембрану . GSWP (0,22 мкм, (Ьшлипор, США) и в фильтрат добавляют 13 мл стерильного 0,01 М фосфатно-солевого буфера с рН 7,2 для снижения концентрации гликопротеинов. Стерильный раствор гликопротеинов (54 мл) содержит в 1 мл 520 мкг белка, 54%i 300 мкг гемагглютинина, 66%; 30 мкг цетилшфндинийхлорида; имеет титр РГА 1:8192 и 63% нейрашнидазной активности от активности исходного виру сй. Степень чистоты полученного препарата аналогична описанной в примере 1f при хранении в растворе при 4°С в течение. 1 года активност гемагглютинина и нейраминидазы снижается на 20%. При разведении до 15 мкг гемагглютинина в дозе препарат оказался апирогенным. Пример 5. Получение глико протеинов вируса гриппа А/Техас/77 низкоскоростным центрифугированием К 10 мл очищенного концентрата вируса гриппа А/Техас/77 (H3N2),со держащего в 1 мл 980 мкг белка, 390 мкг гемагглютинина с титром РГ 1:81920, добавляют 0,2 мп 5%-ного водного рйств.ора цетилпиридинийхло рида (соотношение детергент:белок равно 1:1), перемешивают в течение--1 ч при 20°С и центрифугируют при 6000- g в течение 10 мин. Супернатант (10 мл, белок 620 мкг/ 63%; гемагглютинин - 270 мкг/мл, 69%; титр РГА - 1:24576, нейрамини дазная активность 65% от исходного охлаждают при в течение 16 ч и центрифугируют при при 15000 в течение 15 ъшн, Супернатант (10 белок 5.70 мкг/мл, 58%; гемагглютинин 250 мкг/мп, 65%; титр РГА 1:81920; нейраминидазная активност 61%, цетилпиридинийхлорид 0,003%) стерилизуют пропусканием через мембрану GSWP (0,22 мкм, Шллипор, США) и получают стерильный раствор гликоПротеинов (10 мл, белок 440 мкг/мл, 45%; гемагглютинин 220 мкг/мл 57%; титр РГА 1:65536, нейраминидазная активность 54% от активности исходного вируса). Степень чистоты полученного препарата аналогична описанной в примере 1 . Пример 6 (прототип). К 10 мл очищенного концентрата вируса гриппа Aj/Ленинград/385/80 (H3N2), содержащего в 1 мп 700 мкг белка, 310 мкг гемагглютинина, с титром РГА 1:16384 добавляют 0,7 мл О,5%-ного водного раствора цетилпиридинийбромида (соотношейие детергент:белок равно 1:2), вьдерживают в течение 1 ч при 20 С и смесь ультрацентрифугируют (ультрацентрифуга Бекман L 65, рот.ор 60 Ti) при 105000 g в теченне 1,5 ч. Супернатант, фрак1дия солюбилизированных иммуногенных гликопротеинов, (10 мл) содержит в 1 мл : белка - 230 мкг, 33%;гемагглютинина 93 мкг, 30%; имеет титр 1:2048 и 26% нейраминидазной активности. Подобные результаты получены . при использовании цетилпиридиний-у хлорида вместо цетилпиридинийбромида в аналогичных условиях. Пример 7 (прототип). Этот пример отличается от примера 6 тем, что соотношение цетилпиридинийбромида к белку равно 1:5. Полученный раствор гликопротеинов содержит в 1 мл: белка - 70 мкг, 10%;гемагглютинина 25 мкг, 8%; титр РГА 1:512 и 8% «ейраминидазной активности. Таким образом, из сравнительных примеров .следует, что как в случае цетилпиридинийбромида, так и цетилпиридинийхпорида при максимальном соотношении детергент:белок, равном 1:2, как указано в известном способе, выход солюбилизированных гликопротеинов составляет 26-33%. Основньв4И преимуществами предполагаемого способа получения иммуногенных гликопротеинов вируса гриппа с катионньм детергентом - цетилпиридинийхлоридом являются: использование при вьщелении иммуногенных гликопротеинов ультрафильтрации или низкоскоростного центрифугирования, что позволяет упростить способ, которьй не требует дорогостоящего оборудования (ультрацентрифуги) и высококвалифицированного технического обслуживания использование соотношения цетилпирчцинийхлорид:белок 1,0:1-1,5:1 позволяет повысить выходы гемагглютинина и нейраминидазы с 26-30% до 59-80%; простота удаления выпавшего осадка цетилпиридинийхлорида декантацией или микрофильтрацией, наряду с небольшими потерями (5-10%) гликопротеинов, в отличие от обычно применяемого для удаления детергента продолжительного и связанного с потерями диализа; использование кассет тангенциального потока (для ультра- и микрофильтрации) и дешевых отечественных полиядерных мембран упрощает технологический процесс получения гликопротеинов.

Та блица 1

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОГЕННЫХ ГЛИКОПРОТЕИНОВ ВИРУСА ГРИППА путем обработки очищенного концентрата вируса катионным детергентом цетилпиридинийхлоридом, отделения полученных гликопротеинов и удаления из раствора катионного детергента, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, обработку концентрата проводят при массовом соотношении детергента к белку вирусного концентрата, равном 1,0:1-1,5:1, а отделение детергента осуществляют при температуре 1-4С. i

мл мкг/мл

%

мкг/мл .

условная единица активности)

Нейраминидаэа РГА титр в пробе

Белок

Гемагглютинин

20

20

230

256

60

67

60

71

50

59

165

171

50

55

1024

5120 ,Препарат полученный после обработки (1 ч, ) концентрата вируса гриппа цетилпиридинийхлоридом -5%-ным водным раствором (0,15 мл), и последующего пропускания смеси через мембрану с диаметром пор 5212 нм. Препарат, полученный после охлаждения (, 16 ч) ультрафильтрата и отделения осадка детергента на полиядерном фильтре с диаметром пор 420t20 нм. Количество (мкг) N-ацетилнейраминовой кислоты, отцепившейся от овомуцина в расчете на 1 мл раствора гликопротеинов. Таблица 2

условная единица активности 1050 780

100 93

16384 2048

620

700

186

158

60

100

83

51

8192 16384

6044

1024