Способ определения коэффициентов задержания микрофильтрационных мембран Советский патент 1986 года по МПК C12Q1/00 B01D13/00 

f

Изобретение относится к физической химии, а именно к процессам мембранного разделения биологических суспензий калибровки микрофильтра- ционнык мембран.

Цель изобретения - повьшение точности определения коэффициентов за- . держания микрофильтрационньк мембран - достигается за счет более точного моделирования реальных процессов разделения биологических суспензий в результате добавления в калибровочный раствор биологических частиц в концентрации 210 -4 х, X 10 1/см

Калибровочньй раствор, содержа-г jrpra смесь белков и аминокислот и/или пептидов с ММ 200-240000 дальтон, в концентрациях 0,05-6,7 мг/мл и биологические частицы (вирусы, бактерии и т.д.) в концентрации 210 - 4 1/см, фильтруют через мембрану (ацетилцеллюлозные мембраны типа Биопор, полиамидные, ядерные лавсановые фильтры).

В начальный период процесса и после концентрации (К) отбирают пробы фильтрата и концентрата (по 0,4мл каждого) и анализируют концентрации их компонентов гель-хроматографией на колонке, наполненной ультрагелем , при скорости элюции 3,5 - 4 СМ /ч. После этого по площадям (высотам) соответствующих гель-хр0- матографических пиков находят коэффициент задержания согласно формуле

Ctpi

(1)

Hi

где С. и С,концентрации .г-го компонента в фильтрате и концентрате, выраженные в ед шицах площади (высоты пиков на хроматограмме).

Пример 1. Калибровочную смесь 100 мл, представляющую собой раствор триптофана (, мг/мл) химотрилсиногена ( тыс.), яичного ( тыс,) и ч человеческого сывороточного ( тыс) альбуминов, У -глобулина (М 1 60 тыс« ), каталазы . ( тыс,) концентрации каждого 0,4 мг/мл и частиц вируса гриппа в концентрации 10 I/CM фильтруют в ячейке с механическим перемешиванием через ацетатцеллюлшзную мембрану Биопор М-0,1. Средний диаметр пор 1000 А . После пропускания 90 мл в фильтрат () отбирают пробы фильтрата и концентрата, котарые

12474202

анализируют на. гель-хроматографичес- кой колонке 0,9x60 см, наполненного ультрагелем АсА-34, при скорости элюции 4 см /ч. По гель-хроматограммам фильтрата и концентрата согласно формуле () были рассчитаны коэффициенты задержания в зависимости от молекулярного веса (например, для веществ с мол. вес, 59000-10000 ,9-0,95) . По способу-прототипу расчетные данные бьши существенно занижены - вещества с ука.занными молекулярными весаш- прэ- ходили полностью.

В таких же условиях на/ указанной мембране фильтровали вируссодержащую аллантоисную жидкость с концентрацией вирусов 1/см , обттч содержанием белка 1 ,6 мг/мл, содерлсанием оваль- бумина 0,9 мг/мл и концентрировали в 10 раз. При этом концентрация оваль- бумина возросла до 8 мг/мл, что соответствует ,95, а белок с мол, мае. 60 тыс.дапьтон задерживался пол- ност1 ю, что согласуется с расчетными

данными, 1

П р и м е р 2. Калибровочную смесь объемом 2000 см , представляющзпо собой НЕСХОДНУЮ культуральнзто жидкость Serratia Marcescens с концентрацией бактерий 2x10 1/см с добавлением пепсина ( тыс.дальтон) в концентрации 0,5 мг/мл, фильтруют на аппарате типа фильтр-пресс, снабженном мембpaнa И Биопор М-0,1 , с обшей поверхностью фильтрации 4000 см . После дост1-:жения 10-кратной степени концентрирования отбиршот фильтрат и концентрат и анализировали их гельхроматографией на содержание пепсина. По формуле (1) был рассчитан коэффициент задержания пепсина, который был равным 0,03. На этом же аппарате проводилась микрофильтрация реальной

культуральной лшдкостп Serratia Marcescens с концентрацией бактерий 2x10 1/см , содержащей целевой фермент эндонуклеазу (ММ 30-36 тыс, дальтон), После достижения 10-кратной степени концентрирования отбира- xtpi пробы фильтрата н концентрата, которые тестировались на содержание эндонукхсеазы по гидролизу высокопо- Х имерной РНК и по отношению активностей в фильтрате и концентрате согласно формуле (1) был определен ко- эффии;иент задержания эндонуклеазы ,05, который согласуется с Ч пеп

сина, имеющего близкую к эндонуклё- азе молекулярную массу.

П р и м е р 3. Калибровочную смесь объемом 2000 см , представляющую собой раствор молочного альбумина, яичного альбумина, человеческого сывороточного альбумина, -глэ- булина с начальными концентрациями по 0,5 мг/мл каждого и вируса гриппа начальной концентрации 2x10 1/см фильтруют на аппарате типа фильтр- пресс, снабженного мембранами Биопор AM ( А ) с рабочей поверхностью 400 см.

При различных; степенях концентрирования, концентрациях белка (2- 6,7 мг/мл) и вируса гриппа (4 х X l/CM) согласно методике примера 1 при скорости элюции 3,5 см /ч были определены коэффициенты задержания указанных белков, которые оказались равными: ,2010,05 ;

После 1-кратно- .го концентрирования0,337-0,645

После диафршьтрации, кратность

120,160-0,323

Согласно ТУ И2.14.149-78 на полуфабрикат гриппозной вакцины коцентрация общего белка не должна превышать 0,15 мг/t-m, концентрация овальбумина мкг/мл.

Редактор М.Келемеш

Составитель А.Переверзева

Техред В.Кадар Корректор Г,Решетник

Заказ 4080/26 . Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб, д.4/5

- Производственно-пвлиграфическое предприятие,г.Ужгород,ул.Проектная,4

10

2474204

- 0,5±0,1; Lf- 0,,10; ч; 0,6Г ±0,1 1 .

По результатам калибровки мембраны Биопор-Ам (по коэффициенту задер- 5 жания овальбумнна 4ggO,5tO,l - лимитирующий фактор) бьши рассчитаны параметры процесса мембранной очистки вируссодержащей алантоисной жидкости, необходимые для получения стандартной гриппозной вакцины. Согласно расчетам было получено: степень коцентрирования 10-15, кратность ди- афильтрации 10-12. Проведенная наработка опытных партий вакцин по расчетной технологии позволила получить продукт, удовлетворяющий ТУ как по овальбумину, так и по общему белку, и показала хорошее совпадение расчетных и экспериментальных данных.

Сравнение экспериментальных и расчетных данных в процессе получения гриппозной вакцины приведено в таблице.

15

2(3

107-173

0,08-1,4

0,5 0,07