Штамм @ . @ @ 853,содержащий гибридную плазмиду @ 4-продуцент 3,5-циклического аденозинмонофосфата Советский патент 1984 года по МПК C12N15/00 

(Л

С

Штамм Е. coli L BG 853, содержащий гибридную гшазмиду р TG 4, № 287 (коллекция Ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи АМН СССР) продуцент З, 5-циклического аденозинмонофосфата.

05 00

00

05 1 Изобретение относится к биотехнологии, микробиологии и медицине, в частности к получению 3, 5-цикличес кого аденозинмонофосфата (цАМФ) пут микробиологического синтеза. 11ДМФ широко используется в клинической практике в диагностических целях, в частности при д;;агностике патологических состояний нервной системы (эпилепсии, шизофрении и др.). Определение содержания цАМФ в крови, церебросгтнальной жидкости и т.д. является важным диагностическим признаком. Кроме того, этот цикличес кий нуклеотид необходим в научных ис следованиях, связанных с изучением бактериальных и эукариотических аденилатциклаз. Известен штамм-продуцент цАМФ, полученньй на основе введения мутаци по белку CRP в UITHMM Е. coli l . Однако известный штамм характеризуется низкой продукцией цАМФ О,12 мг/кп. Цель изобретения - создание генно инженерным способом высокопродуктивного штамма-продуцента , непатогенного для человека и животных и нетребовательного к питательным средам. Предлагаемый штамм L BG 853, содержа1цИй гибридную плазмиду р TG4, продуцирует в среду в 10 раз больше по сравнению с известным штаммом-продуцентом . Этот штамм создан на основе Е. co li К-12, которая не может колонизировать тонкий кишечник животных и человека. Штамм содержит гибридную плазмиду р TG 4, которая несет ген аденилатциклазы Е. coli. Указанная гибридная плазмида р TG 4 создана на основе мультикопий ного вектора р ВР 325 и содержит вставку ДНК в Pst 1 сайте размером 3,6 Мд. Количество копий плазмиды р TG 4 составляет около 15-18 в расчете на одну бактериальную хромосому Штамм L BG 853 содержит мутацию по структурному гену сгр. Совмещение мутации по белку CRP и гибридной пла миды в одном штамме делает его значи тельно более продуктивным; содержани цЛМФ в среде достигает более высоког уровня по сравнению с бесплазмидным штаммом. Полученный штамм хранится в музее культур п лиофилизироилнюм виде в 6 лаборатории генетической регуляции биохимических процессов ИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи АМН СССР под регистрационным номером 287. Характеристика штамма. Морфологические признаки. Клетки прямые палочковидной формы, 1,1-1,5x2,0-6,0 мк, подвижные с перитрихальными жгутиками, граммотрицательные, неспорообразующие. Культуральные признаки. Индикаторная среда МакКонки с мальтозой (1%). Колонии светло-розового цвета, блестящие с гладкими краями, через 24 ч культивирования достигают 1,5-2 мм в диаметре. Среда Хоттингера. Мелкие компактные колонии с ровными краями. Через 24 ч культивирования достигают 1,5 мм в диаметре. Среда М-9 с триптофаном (50 мкг/мл),аденином (20 мкг/мл) и глюкозой (2 г/л). Колонии светло-серого цвета, мелкие компактные с ровными краями, Физиолого-биохимические признаки. Оптимальная температура культивирования 37°С. Бактерии в качестве источника азота используют минеральные соли в аммонийной и нитритной форме, а также органические источники азота, такие как пептиды, аминокислоты. Желатину не разжижают. Индола не образуют. Устойчивы к тетрациклину и хлорамфениколу. Непатогенны для лабораторных животных и человека. Для количественного определения цАМФ в культуральной среде используют набор реактивов для определения цАМФ фирмы Амершам (Англия).. Приме р.ШтаммЬВС 853,содер-. гибридную плазмиду р Td 4 выращивают на минимальной синтетической среде М-9 с казаминовыми кислотами и глюкозой (0,5%). Через 24 ч культивирования с аэрацией при 37 С определяют содержание цАМФ в среде. ля этого используют набор реактивов для определения цАМФ фирмы Амершам Процедуру по определению концентрации цАМФ проводят в соответствии с прилагаемой фирмой прописью. В случае тамма L BG 853, содержащего плазмиду TG 4, содержание цАМФ в среде составляет 1,1 мг/мл. Таким обра.зом, иааатогенность и высокая продуктивность прелагаемого,

штамма делает его перспективным для его культивирования относительно производства цАМФ путем микробио- недорогая и проста по состалогического синтеза. Среда для ву.