Штамм @ @ @ 1672-продуцент холерного токсина Советский патент 1987 года по МПК C12N15/00 

;о

о

Изобретение относится к медицине и ветеринарии, а именно к получению непатогенного штамма , coli, проду1 ирующего холерный токсин.

Цель изобрефения - создание генноинженерным способом непатогенного для человеке и животных штамма с повышенной продукцией холерного токсина.

Пример. Предлагаемь } штамм Е. coli KS1672 является непатогенным для человека и животных и синтезирует не менее 1 мг холерного токсина на 1 л культуральной среды.

Штамм KS1672 создан на основе хорошо изученного лабораторного штамма НВ 101 (Tg, FB, RecA производного штамма Е. coli К-12), широко используемого в генетических экспериментах. Этот штамм йе может колонизировать кишечник человека или животных - место действия холерного токсина - и не выживает при совместном культивировании с нормальной кишечной микрофлорой.

Штамм KS1672 содержит гибридную плазмиду pCTIIO, детерминирующую синтез холернох о токсина. Плазмида рСТ 110 создана на основе векторной плазмиды pBR 322. Донорной ДНК служит хромосомная ДНК, вьзделенная из V:cholerae RV 79. Конструирование плазмиды рСТИО осуществляют с помощью рестрикционной зндонуклеазы Pst 1. Полученная гибридная плазмида содержит вставку размером 5,7 тысяч нуклеотидных пар. Количество копий плазмиды рСТПО на одну клетку штамма KS 1672 составляет 15.

Штамм E.coli KS1672 хранится в коллекции Научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи АМН СССР под регистрационным номером 50.

Характеристика штамма.

Морфологические признаки. Клетки прямые, палочковидной формы, 1,1-1,5х х2,0-6 мк, подвижные, с перитрихиальными жгутиками, грамотрицательные, неспорообразующие, кислотонеустойчивые, оксидазоотрицательные.

Культуральные признаки. Хемоорга- . нотрофы. Метаболизм дыхательный и бродильный, каталазо-положительные.

Среда Эндо. Колонии бледно-розового цвета, блестящие, с ровными краями, через 24 ч достигают 1,0 1,2 мм в диаметре.

Мясо-пептонный агар. Колонии беловатого оттенка, вязкой консистенции, гладкие, круглые, прижатые, с ровными краями.

Кровяной агар. Колонии бледно-серого цвета, круглые, с ровными краями. Гемолиз не выявлен.

Среда Эванса. Аэробные условия выращивания. Через 5ч образ5пот муть. 0 Через 15 ч на дне пробирки появляется микробная взвесь сероватого цвета.

Мясо-пептонный бульон. Аэробные условия выращивания. Через 6 ч образуют ровную интенсивную муть. Через 5 24 ч на дне пробирки появляется микробная взвесь серовато-белого цвета.

Казамино-дрожжевой бульон. Через 18 ч при 30 С образуют ровную интенсивную муть.

Физиолого-биохимические признаки. Бактерии штамма Е. coli KS1672 растут в пределах от 5 до 43°С при оптимуме 37 С и рН 6,8. В качестве источника углерода используют многие углеводы, спирты, органические кислоты. Глюкоза, мальтоза, арабиноза, рамноза и другие углеводы сбраживаются с образованием пирувата.

Бактерии в качестве источника азота используют как минимальные соли в аммонийной и нитратной форме, так и в органической, форме в виде пептона, аминокислот. Желатину не разжижают. Уреазной активностью но оёла5 дают. Индола не образуют. Устойчивы к тетрациклину (20 мкг/мл). Непатогенные для лабораторных животных.

Для количественного определения

Q холерного токсина используют иммуноферментативный метод. В качестве контроля и для определения чувствительности метода используют очищенный препарат холерного токсина.

Бактериальные клетки объемом 50 мл .выращивают 18 ч при 37 С в 0,5-лит-,, ровых колбах в среде, содержащей 3%-ные казаминовые кислоты и 0,5%-ный дрожжевой экстракт при рН 7,7-7,8.

Q Клетки осаждают центрифугированием и ресуспендируют в0,05М трис НС1 рН 8,6 с 0,2 М NaCl. Клеточную суспензию подвергаютозвучиванию в ультразвуковом дезинтеграторе. Используют последовательные, двухкратные разведения клеточных лизатов. Пробы инкубируют в течение 1 ч с сенсибилизированной ганглнозвдами поверхностью лунок микроплат. Инкубацию с антитоксической противохолерной сывороткой, разведенной 1:200, проводят в течение liB ч при комнатной температуре. После промывания 0,05 М фосфатным буфером рН 7,2 в лунки добавляют по 0,2 мл раствора иммуноферментных конъюгатов в разведении 1:300. Конъюгаты состоят из F ав-фрагмента антител барана к иммуноглобинам кролика и пероксидазы. Реакцию учитывают через 30 мин после добавления субстрата - 0,003% перекиси водорода в 0,15 М NaCl и П-фенилендиамина. При двухкратной раститровки клеточных лизатов исходного штамма V. cholerae RV 79 положительная реакция наблюдается в разведении 1:128, В то же время лизаты клеток штамма KS1672 дают положительный результат в разведении . 1:1024. Чувствительность метода Gm, а ISA составляет в данной серии опытов 1 нг/мл. В соответствии с установленной чувствительностью метода и подсчетом числа выросших в процессе культивирования микробных клеток рассчитывают количество продуцируемого холерного токсш а у исследуемых штаммов. Штамм V,choleraeRV79 продуцирует 0,45 мг токсина на 1 л куль-, туральной жидкости, а штамм KS1672, содержащий плазмиду рСТ 110 - 1 мг

токсина на 1 л культуральной жидкости.

Таким образом, полученный непатогенный штамм Е. coli KS1672 является

перспективным для налаживания производства очищенного препарата холерного токсина. Препарат холерного токсина необходим для получения химических вакцин, антисывороток и других

диагностических препаратов против диарейных заболеваний животных и человека, вызываемых V.cholerae и патогенными E.coli.

Штамм Escherichia coli KS1672 № 50 (коллекция Научно-исследовательского института эпидемиологии им. Н.Ф.Гамалеи)- продуцент холерного токсина.