Способ удаления белков из водных растворов Советский патент 1984 года по МПК B01J19/04 G01N33/18 

Изобретение относится к области биохими и может быть использовано для уцаления белков, ферментов, антигенов и антител, токсинов и других биологически активных веществ белковой природы из водных растворов. Известны способы удаления белков из во ных растворов, основанные на осаждении белков нагреванием или обработкой кислотами 1 . Недостатки удаления белков обработкой кислотами заключаются в загрязнении безбел кового фильтрата агрессивными в химическо отношении веществами. Кипячение непригодн для депротеинизации разбавленных растворов Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому полож тельному эффекту является способ удаления белков из водных растворов, включающий адсорбцию белков на сорбенте, в качестве которого используют гидроокись цинка, и отделение депротеинизированного раствора фильтрацией 2. Однако известный способ сложен и длителен, так как необходимо перед удалением белков получать сорбент путем смещивания сернокислого цинка с щелочью и последующего кипячения и фильтрования. Сама депротеинизация также включает стадию термообработки. Депротеинизированные растворы загрязняются ионами тяжелого металла - цинка. Целью изобретения яв.пяется упрощение и ускорение процесса удаления белков из водных растворов. Поставленная цель достигается тем, гто со ласно способу удаления белков из водных растворов, .включающему адсорбцию белков на сорбенте и отделение депротеинизированного раствора фильтрованием, в качестве сор бента используют гидрофильный аэросил, а адсорбцию проводят при рН 1-5,6. Предлагаемый способ заключается в том, что в качестве сорбента используется гидрофильный аэросил, обладающий способностью адсорбировать белки, не адсорбируя при зтом декстраны, гепарин, хлорофос, органические и неорганические кислоты. Адсорбция аэросилом белков протекает значительно более эффективно, чем адсорбция щелочей, ацетона и аминокислот (табл. ). Депротеинизацию следует проводить при рН среды 1 5,6, так как дальнейщее увеличение рН приводит к снижению эффективности сорбции белков на аэросиле. Аэросил депротеинизирует водные растворы практически мгновенно (необнаружено существенной разницы в депро теинизирующем действии при контакте АС с раствором белка в течение 1 и 10 мин). Для депротеинизации могут быть использованы различные типы гидрофильных аэросилов (например. А-300 и А-175), с удельной поверхностью соответственно 300 и 175 м /г). Для полного удаления белка из водных растворов требуется добавлять не менее 1 г азросила А-300 на каждьге 160 мг белка. С учетом специфичности адсорбирующего действия аэросила предлагаемый способ может быть с наибольщей эффективностью использован для удаления белков из растворов, содержащих полисахариды, хлорофос, гепарин и органические кислоты. Преимущества способа заключаются в его простоте и быстром протекании депротеинизации. Способ иллюстрируется следующими примерами осуществления. Пример 1.В пробирку наливают 9,8 мл физраствора (рН 5,6) и 0,2 мл лопхадиной сыворотки, вносят 100 мг аэросила А-300. Содержимое пробирки встряхивают и фильтруют через бумажный фильтр. В фильтрате определяют наличие белка пробой с сульфосалициловой кислотой (ССК), для чего к 2 мл фильтрата добавляют 4 капли 20%-ного раствора ССК. Весь белок из 0,2 мл лощадиной сыворотки (около 16 мг) адсорбируется на 100 мг аэросила А-300. В табл. 2 приведены данные по депротеинизации. водных растворов, содержащих разные количества сыворотки. В описанных условиях опыта 100 мг аэросила А-300 способны адсорбировать на себе весь белок, содержащийся в 0,2 мл сыворотки, т. е. около 16 мг белка (16% от веса препарата). . Такие же данные были получены при использовании в качестве источника белка аптечного препарата Инсулин для инъекций ; Для полного удаления белка к 5 мл препарата оказалось необходимо добавить 300 мг аэросила А-300. В табл. 3 приведены данные о влиянии рН на эффективность депротеинизации. Адсорбция белка аэросилом А-300 в значительной степени зависит от рН раствора. При рН 5,6 и ниже из сыворотки крови, содержащей больщое количество различных по своим физико-химическим свойствам белков, аэросилом удаляются все без остатка белки. Альбумин полностью адсорбируется при рН 6,2 и ниже. При сдвиге рН в щелочную сторону адсорбция белков аэросилом уменьшается. Аналогичные результаты получены при определении белка по методу Лоури. Примерно равную адсорбционную способность по отнощёнию к белкам в водной среде проявляют другие марки аэросила (А-175, А-380), в связи с чем их депротеинизирующее действие можно считать закономерным свойством всех марок гидрофильного аэросила.

Пример 2. Для доказательства полной депротеинизации водных сред аэросилом испольэован также наиболее чувствительный метод - ферментативный. Исчезновение ферментативной активности после обработки азросилом является доказательством депротеинизации. В качестве источников ферментов использованы кровь (фермент каталаза), слюна (фермент амилаза), аптечный препарат пепсина, экстракт поджелудочной железы свиней и крупного рогатого скота (трипсин).

Во всех случаях добавление аэросила приво дит к полному исчезновению ферментативной активности из анализ1фуемых растворов. Для полной депротеинизации достаточно добавить к растворам следующие количества аэросила А-300: на 10 мл разведенной в 1000 раз крови - 100 мг аэросила (удаление каталаВещество

Белки

(кристаллический альбумин, 6 ферментов сыворотка крови, пищеварительные соки)

8 аминокислот

Органические и неорганические кислоты (уксусная, щавелевая, соляная, серная)

Щелочи (NaOH,KOH)

Ацетон

Хлорофос

Декстран (полиглюкин)

Гепарин (кристаллическ препарат, растворенный в физрастворе)

зы); на 10 мл разведенной в 4 раза слюны 200 мг аэросила (удаление амилазы); на 10 мл 0,1%-ного раствора пепсина-200 мг аэросила; на 10 мл водной вытяжки поджелудочной железы свиней или крупного рогатого скота, а также на 10 мл химуса тонкого кишечника 250 мг аэросила (для ударения амидазы и трипсина).

Таким образом, использование предлагаемого способа депротеинизагши позволяет значительно упростить удаление белка, исключив стадии подготовки сорбента и кипячения белковых растворов. Быстрое связывание белков с азроСШ1ОМ (в течение 1 мин), а также исключение ряда стадий, позволяет значительно ускорить депротеинизацию. Способ не требует специального оборудования. Высокая химическая частота аэросилов, а также их нерастворимость позволяют получить депротеиниэированные водные растворы, несодержащие химически агрессивных соединений. Поглощение,%

100

Осаждение сульфосалициловой кислотой, спектрофотометрия, метод Лоури

Формоловое титрование

15-70 Титрование щелочью О

Титрование кислотой Реакция с нитропруссидом

Реакция с 2,4-динитрофенилгидразином

Интерферометрия То же Таблица 1 Метод определения

Таблица 2

СПОСОБ УДАЛЕНИЯ БЕЛКОВ ИЗ ВОДНЫХ РАСТВОЮВ, включающий адсорбцию белков на сорбенте и отделение депротеинизированного раствора фильтрованием, отличающийся тем, что, с целью упрощения и ускорения процесса, в качестве сорбента используют гидрофильный аэросил, а адсорбцию проводят при рН 1-5,6.