СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОСОРБЕНТА Российский патент 2018 года по МПК C12N11/00 G01N33/53 

Изобретение относится к биотехнологии, иммунохимии, в частности к способам получения специфических иммуносорбентов, и может применяться в медицине в процессах гемосорбции, лимфосорбции и плазмосорбции.

Проблема сохранения внутренней среды организма и его здоровья решается использованием в медицинской практике методов сорбционной детоксикации организма Одно из основных направлений биотехнологии предусматривает разработку сорбционных материалов и дальнейшее их применение в медицине и медицинской промышленности в качестве незаменимых материалов для гемо-, лимфо-, плазмо- и энтеросорбции. Наиболее перспективный метод сорбционной детоксикации организма - гемосорбция, основанная на способности активных сорбентов удалять из крови вредные вещества различной природы, при определенных заболеваниях (онкологических, аутоиммунных, инфекционных, аллергических и т.д.) [Пьянова Л.Г. Углеродные сорбенты в медицине и протеомике // Химия в интересах устойчивого развития. Новосибирск, 2011. Т. 19. №1. С. 113-122].

В связи с высокими требованиями к чистоте биотехнологических продуктов все более актуальной становится задача разработки сорбционных материалов направленного действия, а именно селективных иммуносорбентов. В настоящее время особое внимание уделяется вопросам лечения демиелинизирующих заболеваний центральной нервной системы, среди которых самым распространенным является рассеянный склероз, посредством удаления из системного кровотока пациентов аутоантител, вызывающих деструкцию миелина, составляющего оболочку нервного волокна. Ключевым моментом в этом вопросе является создание механически стабильных сорбентов, способных обеспечивать высокий выход аутоантител к белку миелина [Huang D., Rae-Grant A. Advances in the immune pathogenesis and treatment of multiple sclerosis // Cent. Nerv. Syst. Agents Med. Chem. - 2009. - V. 9, №l. - P. 20-31].

Известен способ получения магноиммуносорбента по которому проводят эмульсионную полимеризацию смеси сомономеров полиакриламида и катализатора с обработанным магнитным порошком. Подготовленный магносорбент активируют 5%-ным глутаровым альдегидом в течение 18-20 ч и иммобилизуют специфичными иммуноглобулинами в растворе ФСБ при инкубации в течение 18-20 ч. Для блокировки несвязавшихся альдегидных групп магноиммуносорбенты дополнительно обрабатывают раствором альбумина в течение 1-3 ч (патент РФ №2068703, A61K 39/385, C12N 11/00 // G01N 33/53, опубл. 10.11.1996; Бюл. №31).

Недостатками способа являются длительность и многостадийность процесса его получения, использование дорогостоящих токсичных реактивов. Полученные по этому способу иммуносорбенты имеют недостаточную специфическую емкость и чувствительность, так как способны к неспецифической сорбции антител и белков из сыворотки крови.

Известен способ получения иммуносорбента (патент РФ №2253871, G01N 33/552, 33/553, опубл. 10.06.2005; Бюл. №16). Способ включает модифицирование аэросила 3-4% раствором хитозана в 3% растворе уксусной кислоты и активирование бензохиноном.

Недостатком указанного способа является низкая чувствительность иммуносорбента и неспецифическая сорбция, что обусловлено наличием на поверхности сорбента функциональных групп, способных к взаимодействию с различными видами иммуноглобулинов.

Наиболее близким к предлагаемому способу является «Способ получения иммуносорбента» (патент РФ №2102134, B01J 20/10. Опубл. 20.01.1998 г. Бюллетень №2). Способ включает модифицирование аэросила декстраном, с последующим окислением перхлоратом натрия.

Способ осуществляют следующим образом: смесь, состоящую из 5 г аэросила и 1 г магнитного порошка, суспендируют в 100 мл 0,5%-ного водного раствора декстрана и далее выдерживают при температуре 24°С 1 ч. Полученный сорбент высушивают при 100-110°С в течение 30 мин. К полученному препарату добавляют 50 мл водного раствора, содержащего 2 г перхлората натрия, инкубируют смесь в темноте 1 ч. Затем сорбент отмывают 100 мл дистиллированной воды. К 0,02 г носителя приливают 1 мл чумных иммуноглобулинов с концентрацией по белку 4 мг/мл. Смесь оставляют при 24°С в течение 2 ч, далее надсадочную жидкость удаляют, а носитель трижды по 10 мл промывают 0,9%-ным раствором хлорида натрия. Результаты определения специфической емкости иммуносорбента проводят методом иммунофлуоресценции.

Однако указанный способ обладает низким уровнем специфической активности иммуносорбента, обусловленной наличием функциональных групп на поверхности сорбента, способных к неспецифической сорбции компонентов сыворотки крови.

Поставлена цель повышение специфической емкости иммуносорбента.

Поставленная цель достигается получением иммуносорбента на основе неорганического носителя - аэросила, поверхность которого активирована полисахаридом - декстраном с дополнительной иммобилизацией конкретного антигена - основного белка миелина.

Способ осуществляют следующим образом.

К 10 г аэросила добавляют 150 мл дистиллированной воды, содержащей 1 г декстрана. Полученную суспензию оставляют созревать при комнатной температуре 24 ч. Время созревания обусловлено протеканием процессов конденсации с участием силанольных групп аэросила. При времени гелеобразования менее 24 ч, не происходит полного вызревания гидрогеля, а более 24 ч наблюдаются процессы старения гидрогеля. Формирование жесткого остова носителя проводят при тщательном перемешивании в течение 1 ч при температуре 110-130°С. Полученный сорбент просеивают через сито с размером ячеек 200-250 мкм, что объясняется максимально возможной рабочей поверхностью гранул. Далее его пятикратно отмывают дистиллированной водой по 100 мл до рН промывных вод 7,0. К 1 г влажного сорбента добавляют 2,0 мл раствора основного белка миелина с концентрацией 0,025-0,125 мг/мл. Объем раствора белка выбран с учетом полной смачиваемости носителя. Концентрация белка обусловлена возможностью более полного проведения процесса иммобилизации. Иммобилизацию проводят в течение 2 ч при температуре 22°С. По завершении процесса иммобилизации носитель с иммобилизованным белком отмывают трехкратно бидистиллированной водой объемом по 50 мл. Затем сорбент обрабатывают 0,1% раствором человеческого сывороточного альбумина в течение 2 ч для активации не связавшихся функциональных групп на поверхности сорбента. Проводят эту процедуру с целью исключения дальнейшей неспецифической сорбции.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Получение иммуносорбента при концентрации белка 0,125 мг/мл. К 10 г аэросила добавляют 150 мл дистиллированной воды, содержащей 1 г декстрана. Полученную суспензию оставляют созревать при комнатной температуре в течение 24 ч. Формирование жесткого остова носителя проводят при тщательном перемешивании в течение 1 ч при температуре 110-130°С. Полученный сорбент просеивают через сито с размером ячеек 200-250 мкм. Далее его пятикратно отмывают дистиллированной водой по 100 мл до рН промывных вод 7,0. Для иммобилизации используют основной белок миелина. К 1 г влажного сорбента добавляют 2,0 мл раствора белка с концентрацией 0,125 мг/мл. Иммобилизацию проводят в течение 2 ч при температуре 22°С. По завершении процесса иммобилизации носитель с иммобилизованным белком отмывают трехкратно бидистиллированной водой объемом по 50 мл. Затем сорбент обрабатывают 0,1% раствором человеческого сывороточного альбумина в течение 2 ч. Сорбционная емкость иммуносорбента относительно специфических антител к основному белку миелина составила 79%.

Пример 2. Получение иммуносорбента при концентрации белка 0,075 мг/мл осуществляют по методике примера 1, но для иммобилизации используют основной белок миелина в концентрации 0,075 мг/мл. Сорбционная емкость иммуносорбента относительно специфических антител к основному белку миелина составила 60%.

Пример 3. Получение иммуносорбента при концентрации белка 0,025 мг/мл осуществляют по методике примера 1, но для иммобилизации используют основной белок миелина в концентрации 0,025 мг/мл. Сорбционная емкость иммуносорбента относительно специфических антител к основному белку миелина составила 34,8%.

В таблице 1 представлены сравнительные данные по сорбционной емкости предлагаемых сорбентов в сопоставлении с сорбентом, полученным известным способом.

Полученный иммуносорбент по предлагаемому способу позволяет увеличить уровень специфической емкости иммуносорбентов относительно антител к основному белку миелина, что позволяет с большей клинической эффективностью использовать разработанный сорбент в лечении аутоиммунных заболеваний, обусловленных повышением аутоантител к основному белку миелина.

Таким образом, дополнительная иммобилизация основного белка миелина на аэросиле и увеличение времени гелеобразования обеспечивает повышение специфичности и увеличение сорбционной емкости, что обусловливает повышение эффективности специфической терапии (по сравнению с лекарственной) больных демиелинизирующими заболеваниями, в частности рассеянным склерозом.

Изобретение относится к области получения сорбентов на основе модифицированного кремнезема, которые могут быть использованы в иммунохимии, биотехнологии и медицине в качестве иммуносорбентов. Способ предусматривает иммобилизацию основного белка миелина на неорганическом носителе - аэросиле, поверхность которого модифицирована декстраном. Изобретение позволяет увеличить уровень специфической емкости иммуносорбентов относительно антител к основному белку миелина. 1 табл., 3 пр.

Способ получения иммуносорбента, включающий добавление к аэросилу водного раствора декстрана, созревание суспензии при комнатной температуре, высушивание сорбента, отмывание его дистиллированной водой, отличающийся тем, что гелеобразование суспензии аэросила с декстраном производят 24 ч с формированием жесткого остова носителя при тщательном перемешивании в течение 1 часа при температуре 110-130°С, с последующим просеиванием полученного сорбента через сито с ячейками 200-250 мкм и пятикратным отмываем полученных гранул дистиллированной водой по 100 мл до промывных вод 7,0 рН, дальнейшим добавлением к 1 г влажного сорбента 2,0 мл раствора основного белка миелина в концентрации 0,025-0,125 мг/мл с проведением 2 ч иммобилизации при температуре 22°С и дальнейшим трехкратным отмыванием носителя с иммобилизованным белком бидистиллированной водой объемом по 50 мл, а для активации не связавшихся функциональных групп на поверхности сорбента отмытый сорбент 2 ч обрабатывают 0,1% раствором человеческого сывороточного альбумина.