СПОСОБ УДАЛЕНИЯ БЕЛКОВЫХ СОЕДИНЕНИЙ ИЗ ВОДНЫХ РАСТВОРОВ Российский патент 2009 года по МПК B01J20/16 C07K1/14 

Изобретение относится к области биохимии и может быть использовано для удаления белков и аминного азота из водных растворов.

Известны способы удаления белков из водных растворов, основанные на осаждении белков нагреванием или обработкой кислотами (Практикум по биохимии / Под ред. С.Е.Северина. - М., МГУ. - 1979. - С.79). Недостатки удаления белков обработкой кислотами заключаются в загрязнении безбелкового фильтрата агрессивными в химическом отношении веществами. Кипячение непригодно для депротеинизации разбавленных растворов.

По технической сущности и достигаемому положительному эффекту наиболее близкими к предлагаемому являются следующие два способа удаления белков из водных растворов.

Первый включает адсорбцию белков на сорбенте, в качестве которого используют гидроокись цинка, и отделение депротеинизированного раствора фильтрацией (Руководство к лабораторным занятиям по биологической химии / Под ред. Т.Т.Березова. - М.: Медицина, 1976. - С.139). Этот способ сложен и длителен, так как перед удалением белков необходимо получать сорбент путем смешивания сернокислого цинка со щелочью и последующего кипячения и фильтрования. Сама депротеинизация также включает стадию термообработки. Депротеинизированные растворы загрязняются ионами цинка.

Второй способ, выбранный за прототип, предполагает использование в качестве сорбента гидрофильного аэросила А-3 00 и А-175 с удельной поверхностью 300 и

175 м²/г (Описание изобретения к авторскому свидетельству (19) SU (11) 1122354 А / Н.Б.Луцюк, П.К.Загниборода, М.Ф.Кулик и др., 1983). Аэросил депротеинизирует водные растворы практически мгновенно. Этот способ эффективно используется для удаления белков из растворов, содержащих полисахариды, хлорофос, гепарин и органические кислоты при рН от 1 до 5,6. Он включает адсорбцию белков на сорбенте и отделение депротеинизированного раствора фильтрованием.

Однако гидрофильный аэросил производится за рубежом (Украина), что вызывает определенные трудности при его приобретении.

Задачей изобретения является расширение технических средств для удаления белковых соединений из водных растворов.

Поставленная задача достигается тем, что согласно способу удаления белковых соединений из водных растворов, включающему адсорбцию белков на сорбенте и отделение депротеинизированного раствора фильтрованием, в качестве сорбента используют гидроалюмосиликатный препарат «Экос», а адсорбцию проводят не менее одной минуты при рН 1-3.

Гидроалюмосиликатный препарат ЛПКД «Экос» - препарат отечественного производства из минерального сырья месторождений Белгородской области. Он предназначен для профилактики расстройств пищеварения и нормализации функции кишечника животных за счет способности связывать и выводить из организма тяжелые металлы и радиоактивные изотопы, нитраты, нитриты и остатки пестицидов, а также токсины патогенных микроорганизмов, и представляет собой порошок светло-серого цвета с желтоватым, зеленоватым или бурым оттенками, без специфического запаха. Величина частиц в основной массе колеблется в пределах от 0,03 до 1000 мкм. Удельная поверхность препарата составляет 1,2-1,9 м²/г. Сорбент содержит следующие элементы в пересчете на оксиды (в мас.%):

мас.% 10^-3 мас.% SiO₂ 50.0-51.2 Ti 80 Аl₂О₃ 13.8-15.7 V 6 СаО 12.6-13.3 Mn 5 Fе₂О₃ 4.27-4.47 Cr 4 MgO 1.66-1.96 Zn 3 ТiO₂ 0.92-0.92 Ni 1 К₂O 0.84-0.84 Co 0.6 Na₂O 0.22-0.22 Cu 0.6 СO₂ 8,58-9,14 Pb 0.3 Н₂О 4,76-4,82 Mo 0.1     w Н/о     Ag H/o     Cd Н/о

Общая удельная радиоактивность на уровне 115,4±8,16 Бк/кг, что не превышает значений ПДК. В состав препарата входят монтмориллонит, каолинит, клиноптилолит, кальцит, опал, полевые шпаты, мусковит и глауконит. (Использование природного гидроалюмосиликата в животноводстве и ветеринарии. Метод. рекомендации / А.А.Шапошников, Н.А.Мусиенко, А.И.Везенцев и др. - Белгород, изд-во Белгородской ГСХА, 2003. - С.4-5).

Гидроалюмосиликатный препарат «Экос» не имеет в своем составе химических веществ, негативно влияющих на организм животных и качество получаемой от них продукции. Добавка нетоксична для животных, не обладает кумулятивными свойствами. Эмбриотоксичность, тератогенность и раздражающее действие экспериментально не установлены (Сертификат соответствия. Минеральная кормовая добавка «Экос» для животноводства № POCC.RU. 11ПН34А.00201 от 12.03.01 г.).

Технический результат - использование предлагаемого гидроалюмосиликатного препарата «Экос» в качестве сорбента белковых соединений позволяет депротеинизировать растворы без подготовки сорбента в течение 1 минуты. Дополнительный технический результат - при этом одновременно из раствора происходит частичное удаление аминного азота.

Предлагаемый способ заключается в том, что для депротеинизации водных растворов, включающей адсорбцию белков на сорбенте и отделение депротеинизированного раствора фильтрованием, в качестве сорбента используют гидроалюмосиликатный препарат «Экос», а адсорбцию проводят не менее 1-10 минут при рН 1-3.

Новизну и изобретательский уровень предложенного способа подтверждает выявленная впервые способность препарата для профилактики расстройств пищеварения и нормализации функции кишечника животных адсорбировать из водных растворов белки и аминный азот. Депротеинизацию следует проводить при рН среды 1-3, так как дальнейшее увеличение рН приводит к снижению результативности сорбции белков гидроалюмосиликатным препаратом «Экос». Водные растворы депротеинизируются гидроалюмосиликатным препаратом «Экос» мгновенно. Не установлено разницы в депротеинизирующем действии гидроалюмосиликатного препарата «Экос» при контакте с раствором белка в течение 1-10 мин. Для удаления из водного раствора 0,76 мг белка требуется вносить 70 мг гидроалюмосиликатного препарата «Экос».

Преимущество способа заключается в его простоте при качественно быстром процессе депротеинизации. К тому же, предлагаемый препарат более доступен и сравнительно дешевле, чем рекомендуемый Н.Б.Луцюком с соавт. (1983) гидрофильный аэросил (соответственно 15 рублей и 20 долларов за 1 кг).

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. В пробирку наливают 9,9 мл изотонического раствора натрия хлорида (рН 5) и 0,1 мл сыворотки крови крупного рогатого скота; вносят 700 мг гидроалюмосиликатного препарата «Экос». Содержимое пробирки перемешивают и фильтруют через бумажный фильтр "синяя лента" (для мелких и самых мелких осадков), промытый предварительно двумя порциями изотонического раствора натрия хлорида (рН 5). Отсутствие белка в фильтрате устанавливают пробой с сульфосалициловой кислотой (ССК). Для этого к 2 мл фильтрата добавляют 4 капли раствора ССК.

Прозрачность смеси свидетельствует об отсутствии белка в фильтрате. Весь белок из 0,1 мл сыворотки (7,6 мг) связывается 700 мг препарата «Экос». В табл. 1 приведены данные исследований по депротеинизации водных растворов, содержащих разные количества сыворотки, путем внесения различных количеств гидроалюмосиликатного препарата «Экос». В описанных условиях опыта 700 мг препарата способны связать весь белок, содержащийся в 0,1 мл сыворотки, т.е. 7,6 мг, что составляет 1,09% от массы навески препарата, внесенной в раствор.

Таблица 1
Установление минимальной депротеинизирующей дозы гидроалюмосиликатного препарата «Экос» Изотонический раствор, мл 9,5 9,7 9,8 9,9 10,0             Сыворотка крови, мл 0,5 0,3 0,2 0,1 - Концентрация белка, 3,80 2,28 1,52 0,76 0,0 мг/мл             Проба с ССК*   20 ++ ++ ++ + - Доза «Экоса», 30 ++ ++ ++ + - мг/мл 40 ++ ++ ++ + - раствора 50 ++ ++ ++ ± - сыворотки 60 ++ ++ + ± -   70 ++ ++ ± - - *ССК - сульфосалициловая кислота «-»- отрицательная реакция «±» - опалесценция «+» - помутнение «++» - появление хлопьев в фильтрате

В табл. 2 приведены данные об объективности связывания белка в 1%-ном водном растворе сыворотки крови при различных значениях рН. Снижение водородного показателя от 5 до 3 и 1 обусловливало уменьшение количества сорбента, необходимого для полной депротеинизации раствора. При рН 3 тест с ССК был отрицательным даже при внесении 300-400 мг гидроалюмосиликатного препарата «Экос» в 10 мл раствора сыворотки крови (7,6 мг белка). При рН 1 достаточными количествами препарата являются 200-300 мг препарата на 10 мл белоксодержащего раствора.

Таблица 2
Влияние реакции среды на сорбционную активность гидроалюмосиликатного препарата «Экос» в 1%-ном растворе сыворотки крови Водородный показатель pH 1 рН 3 рН 5 рН 7 рН 9   Проба с ССК* Доза «Экоса», мг/мл раствора сыворотки (концентрация белка 0,76 мг/мл) 20 - ± + ++ ++ 30 - - + + ++ 40 - - + + ++ 50 - - ± + ++ 60 - - ± + ++ 70 - - - ± ++

Увеличение водородного показателя до 7 (нейтральная среда) заметно повышало минимально необходимую дозу гидроалюмосиликатного препарата «Экос», вызывающую депротеинизацию: лишь 700 мг его, внесенные в 10 мл раствора сыворотки, вызывали частичное связывание белков. Щелочная реакция среды раствора (рН 9) не способствует проявлению обсуждаемых сорбционных свойств гидроалюмосиликатного препарата «Экос» в отношении белков сыворотки крови.

Пример 2. Для подтверждения способности гидроалюмосиликатного препарата «Экос» освобождать водные растворы не только от белковых молекул испытана его активность в отношении аминокислот и их остатков, появляющихся в растворе при гидролизе белков. В качестве объекта выступила жидкая питательная среда для культивирования микроорганизмов - бульон из панкреатического гидролизата кильки (120 мг% аминного азота). О количестве находящихся в нем аминокислот (и их остатков) судили по результатам реакции формольного титрования по Серенсену (Справочник ветеринарного лаборанта / Ф.З.Андросов, И.Я.Беляев, Р.Т.Клочко и др.; под ред. В.Я.Антонова. - М.: Колос, 1981. - С.22-23).

К 10 мл исследуемого бульона добавляли 5 мл свежеприготовленной формольной смеси (50 ч. формалина и 1 ч. фенолфталеина, доведенные 0,2 н. раствором щелочи до слабо-розового окрашивания). Титровали (в трех повторностях) 0,2 н. раствором щелочи (натрия гидроксида) до ярко-красного цвета, после чего добавляли по каплям 0,2 н. раствор соляной кислоты до слабо-розовой окраски жидкости. Получив сходимые результаты титрования, вели расчет содержания аминного азота с учетом разницы между объемами щелочи и кислоты, пошедшими на титрование пробы, и исходя из того, что 1 мл израсходованной щелочи эквивалентен 2,8 г аминного азота.

Снижение количества аминного азота на 34,5% регистрировали в бульоне из панкреатического гидролизата кильки после обработки его гидроалюмосиликатным препаратом «Экос» в концентрации 100 мг/мл при рН 3 (табл.3).

Во всех вариантах опыта увеличение концентрации гидроалюмосиликатного препарата «Экос» и понижение водородного показателя (подкисление среды) приводило к уменьшению содержания аминного азота в питательной среде за счет его связывания «Экосом».

Таблица 3 Результаты титрования бульона из панкреатического гидролизата кильки №   Содержа % убыли опыта Условия опытов ние амин аминного     ного азота, азота     мг %   1. Чистый бульон (фоновый контроль) 119,70 0     50 (рН 7) 103,90 13,2 2. Бульон после обработки 100(рН7) 101,50 15,2   «Экосом» в дозах (мг/мл): 50 (рН 5) 95,50 20,2     100(рН 5) 96,25 19,6     50 (рН 3) 83,33 30,4     100(рН 3) 78,40 34,5

Несмотря на то, что удельная поверхность гидроалюмосиликатного препарата «Экос» значительно меньше, чем у гидрофильного аэросила А-175 и А-300, он способен достаточно эффективно депротеинизировать растворы даже без стадий подготовки сорбента и кипячения белоксодержащих растворов. Связывание белков гидроалюмосиликатным препаратом «Экос» в течение 1 мин и исключение ряда стадий позволяет значительно ускорять депротеинизацию.

Кроме того, гидроалюмосиликатный препарат «Экос» частично связывает и аминный азот жидких питательных сред для культивирования микроорганизмов (с рН 3-7).

Нерастворимость и химическая индифферентность гидроалюмосиликатного препарата «Экос» позволяют получать депротеинизированные водные растворы и питательные среды, частично лишенные аминного азота, не содержащие химически агрессивных соединений.

Изобретение относится к области биохимии и может быть использовано для удаления белков и аминного азота из водных растворов. Способ включает адсорбцию белков на гидроалюмосиликатном природном сорбенте, содержащем такие минералы, как глины, цеолит, полевые шпаты, слюды, кальцит, и фильтрование. Адсорбцию проводят при рН 1-3 1-10 минут. Изобретение позволяет быстро и качественно осуществить процесс депротеинизации раствора. 3 табл.

Способ удаления белков из водных растворов, включающий адсорбцию белков на сорбенте и отделение депротеинизированного раствора фильтрованием, отличающийся тем, что в качестве сорбента используют природный гидроалюмосиликат, содержащий монтмориллонит, каолинит, клиноптилолит, кальцит, опал, полевые шпаты, мусковит и глауконит, а адсорбцию осуществляют в течение 1-10 мин при рН 1-3.