СПОСОБ СИНТЕЗА АЛЬФА-КЕТОМЕТИЛСЕЛЕНОБУТИРАТА Российский патент 2022 года по МПК C07C391/00 

Область техники

Изобретение относится к области препаративного синтеза альфа-кетометилселенобутирата (КМСБ) - метаболита редкой аминокислоты L-селенометионина. Получение КМСБ необходимо для исследования его биологической активности и возможного практического использования в качестве лекарственного препарата.

Уровень техники

При исследовании метаболизма производных L-селенометионина с использованием масс-спектрометрии и высокоэффективной жидкостной хроматографии было показано, что КМСБ образуется in situ при взаимодействии оксидазы L-аминокислот из яда гремучей змеи (Crotalus adamanteus) с L-селенометионином [J. Lee et al. Cancer Prev. Res. 2009, 2, P. 683, doi: 10.1158/1940-6207.CAPR-09-0047; H. Nian et al. Carcinogenesis. 2009, 30, P. 1416, doi: 10.1093/carcin/bgp147; J. Pinto et al. Amino Acids. 2011, 41, P. 29, doi: 10.1007/s00726-010-0578-3]. Эти наблюдения позволили разработать методику определения содержания и превращения КМСБ в живых системах. Возможность превращения L-селенометионина и образование КМСБ была показана также при использовании кинуренинаминотрансферазы III и глутаминтрансаминазы L [J. Pinto et al. J. Biol. Chem. 2014, 289, P. 30950, doi 10.1074/jbc.M114.591461] в результате трансаминирования в присутствии кетокислоты, например, альфа-кетометилтиобутирата, однако и в этом случае была показана лишь принципиальная возможность образования этого продукта. В патенте US 20060105960А1 [Erdelmeir I., Michel J., Moutet M., Yadan J., патент US 20060105960A1, опубл. 18.05.2006] описан способ получения структурного аналога КМСБ 2-гидроксиметилселенобутирата и высказана идея о возможности получения КМСБ с помощью биокаталитической реакции окисления 2-гидроксиметилселенобутирата в присутствии фермента класса оксидоредуктаз, однако нет ни примера синтеза КМСБ, ни указания на конкретный фермент, который мог бы такую реакцию катализировать. Таким образом, как в научной, так и патентной литературе нет сведений о препаративном синтезе и выделении КМСБ, что, вероятно, обусловлено сложностью экспериментальной работы с неприятно пахнущими и реакционноспособными соединениями селена, а также трудностью их выделения.

Раскрытие изобретения

Достигаемым при использовании предлагаемого изобретения техническим результатом является разработка препаративного синтеза и выделения КМСБ.

Технический результат достигается тем, что способ препаративного синтеза КМСБ включает окисление L-селенометионина под действием фермента оксидазы L-аминокислот из Crotalus adamanteus, а также выделение целевого продукта. Способ заключается в том, что готовится концентрированный раствор аминокислоты L-селенометионина и проводится его биокаталитическое превращение под действием оксидазы L-аминокислот для получения КМСБ. Оптимальное время проведения реакции, зависящее от состава и концентраций компонентов реакционной среды, а также условий проведения процесса, выбирается по технологическим, экономическим или иным соображениям, исходя из потребности осуществить процесс за необходимый промежуток времени, и может быть подобрано либо эмпирически, либо по результатам предварительных кинетических экспериментов в соответствующих микрореакторах [R. Wohlgemuth et al. Trends Biotechnol. 2015, 33, P. 302, doi: 10.1016/j.tibtech.2015.02.010; J.L. van Roon et al. Biotechnol. Adv. 2007, 25, P. 137, doi: 10.1016/j.biotechadv.2006.11.005]. В установленных оптимальных условиях биокаталитическое окисление L-селенометионина (Схема 1) может быть проведено с получением концентрированных растворов КМСБ и целевой продукт может быть получен с помощью разработанного метода выделения, описанного ниже.

Предпочтительные методы препаративного выделения КМСБ основаны на использовании принципов ультрафильтрации, ионного обмена и селективной экстракции. Для депротеинизации реакционной смеси после завершения ферментативного превращения используется метод ультрафильтрации, который, например, осуществляется при центрифугировании реакционной смеси в центрифужных фильтрах с мембраной, ограничивающей прохождение молекул с молекулярной массой более 30 кДа. Для выделения целевого продукта из реакционной смеси по мере завершения биокаталитического превращения используется метод ионного обмена, для чего раствор необходимо пропустить через колонку, заполненную катионообменной смолой в Н-форме, собрать фракции, содержащие альфа-кетометилселеномасляную кислоту и экстрагировать целевой продукт органическим растворителем (гептан, бензол, толуол, четыреххлористый углерод, хлороформ, хлористый метилен или их смеси), который затем удаляется отгонкой или в вакууме. Структура синтезированного КМСБ подтверждена методом масс-спектрометрии, содержание КМСБ в полученном препарате подтверждено методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Таким образом, результатом заявленного способа является препарат КМСБ, полученный с выходом не менее 40% по отношению к исходному L-селенометионину. Прикладным аспектом настоящего изобретения является то, что КМСБ представляет интерес как биологически активное соединение, которое потенциально может быть использовано в качестве лекарственного препарата [J. Pinto et al. J. Biol. Chem. 2014, 289, P. 30950, doi: 10.1074/jbc.M114.591461].

Осуществление изобретения

Ниже представлены примеры реализации и более детальное описание заявляемого способа, которое не ограничивает объем притязаний заявляемого изобретения, и демонстрирует возможность осуществления изобретения с достижением заявляемого технического результата. Все используемые реагенты являются коммерчески доступными, все процедуры, если не оговорено особо, осуществляли в диапазоне температур от 10 до 35°С.

Пример 1. Синтез и выделение КМСБ

Навеску 500 мг L-селенометионина растворяли в 21,8 мл дистиллированной воды. Доводили рН раствора до 7,4 с помощью 1 М NaOH. Раствор переносили в колбу объемом 500 мл и добавляли раствор (около 3,2 мл), содержащий 125 мг оксидазы L-аминокислот из Crotalus adamanteus. Начальная концентрация L-селенометионина в реакционной смеси составила 102 мМ, оксидазы L-аминокислот 5 мг/мл. Смесь инкубировали при 20°С и перемешивании со скоростью 120 об/мин в термостатируемом шейкере, расположенном в вытяжном шкафу, работающем на максимальной мощности. По завершении ферментативного превращения реакционную смесь центрифугировали при 12000g в течение 30 минут. Надосадочную жидкость депротеинизировали методом ультрафильтрации с помощью центрифужных фильтров с мембраной, ограничивающей прохождение молекул с молекулярной массой более 30 кДа. Ультрафильтрацию проводили при 4°С и 4000g в течение 20-25 минут. Депротеинизированный раствор пропускали через колонку (длина 40 см, диаметр 20 мм), заполненную катионообменной смолой в Н-форме, с помощью насоса высокого давления со скоростью 6 мл/мин и элюировали дистиллированной водой с той же скоростью с термостатированием при 4°С. Ионообменную смолу предварительно активировали последовательным промыванием 500 мл дистиллированной воды, 100 мл 1 М HCl и 500 мл дистиллированной воды до нейтральной реакции водного элюата (рН 6,0-6,5). Собирали фракции элюата объемом 4 мл. Фракции, содержащие альфа-кетометилселеномасляную кислоту, объединяли, к раствору альфа-кетометилселеномасляной кислоты добавляли концентрированную хлористоводородную кислоту до рН 1,9, переносили в делительную воронку объемом 500 мл с притертой пробкой, добавляли 70 мл хлористого метилена, энергично встряхивали в течение 3-5 минут и оставляли на 5 минут в вертикальном положении для разделения фаз. Нижнюю органическую фазу, содержащую целевое соединение, отделяли, переносили в круглодонную колбу объемом 1 л и упаривали на роторном испарителе до объема 10-15 мл при 40-60 мм.рт.ст. Образующийся остаток органической фазы 10-15 мл переносили в круглодонную колбу объемом 25 мл и после полного удаления органического растворителя при помощи роторного испарителя получали препарат КМСБ. Структура и содержание КМСБ были подтверждены методами масс-спектрометрии и хроматографического анализа. Выход КМСБ составил 49%.

Пример 2. Синтез и выделение КМСБ

Навеску 250 мг L-селенометионина растворяли в 20 мл дистиллированной воды. Доводили рН раствора до 7,5 с помощью 1 М NaOH. Раствор переносили в колбу объемом 250 мл и добавляли раствор (около 1,5 мл), содержащий 60 мг оксидазы L-аминокислот из Crotalus adamanteus. Начальная концентрация L-селенометионина в реакционной смеси составила 59 мМ, оксидазы L-аминокислот 2,8 мг/мл. Смесь инкубировали при 25°С и перемешивании со скоростью 180 об/мин в термостатируемом шейкере, расположенном в вытяжном шкафу, работающем на максимальной мощности. По завершении ферментативного превращения реакционную смесь центрифугировали при 12000g в течение 30 минут. Надосадочную жидкость депротеинизировали методом ультрафильтрации с помощью центрифужных фильтров с мембраной, ограничивающей прохождение молекул с молекулярной массой более 30 кДа. Ультрафильтрацию проводили при 4°С и 4000g в течение 20-25 минут. Депротеинизированный раствор пропускали через колонку (длина 40 см, диаметр 20 мм), заполненную катионообменной смолой в Н-форме, с помощью насоса высокого давления со скоростью 6 мл/мин и элюировали дистиллированной водой с той же скоростью с термостатированием при 4°С. Ионообменную смолу предварительно активировали последовательным промыванием 500 мл дистиллированной воды, 100 мл 1 М HCl и 500 мл дистиллированной воды до нейтральной реакции водного элюата (рН 6,0-6,5). Собирали фракции элюата объемом 3 мл. Фракции, содержащие альфа-кетометилселеномасляную кислоту, объединяли, к раствору альфа-кетометилселеномасляной кислоты добавляли концентрированную хлористоводородную кислоту до рН 1,9, переносили в делительную воронку объемом 250 мл с притертой пробкой, добавляли 50 мл гептана, энергично встряхивали в течение 3-5 минут и оставляли на 5 минут в вертикальном положении для разделения фаз. Верхнюю органическую фазу, содержащую целевое соединение, отделяли, переносили в круглодонную колбу объемом 0,5 л и упаривали на роторном испарителе. После полного удаления органического растворителя получали препарат КМСБ. Структура и содержание КМСБ были подтверждены методами масс-спектрометрии и хроматографического анализа. Выход КМСБ составил 43%.

Пример 3. Синтез и выделение КМСБ

Навеску 105 мг L-селенометионина растворяли в 50 мл дистиллированной воды. Доводили рН раствора до 7,2 с помощью 1 М NaOH. Раствор переносили в колбу объемом 500 мл и добавляли раствор (около 2 мл), содержащий 26 мг оксидазы L-аминокислот из Crotalus adamanteus. Начальная концентрация L-селенометионина в реакционной смеси составила 10 мМ, оксидазы L-аминокислот 0,5 мг/мл. Смесь инкубировали при 15°С и перемешивании со скоростью 150 об/мин в термостатируемом шейкере, расположенном в вытяжном шкафу, работающем на максимальной мощности. По завершении ферментативного превращения реакционную смесь центрифугировали при 12000g в течение 30 минут. Надосадочную жидкость депротеинизировали методом ультрафильтрации с помощью центрифужных фильтров с мембраной, ограничивающей прохождение молекул с молекулярной массой более 30 кДа. Ультрафильтрацию проводили при 4°С и 4000g в течение 20-25 минут. Депротеинизированный раствор пропускали через колонку (длина 40 см, диаметр 20 мм), заполненную катионообменной смолой в Н-форме, с помощью насоса высокого давления со скоростью 10 мл/мин и элюировали дистиллированной водой с той же скоростью с термостатированием при 4°С. Ионообменную смолу предварительно активировали последовательным промыванием 500 мл дистиллированной воды, 100 мл 1 М HCl и 500 мл дистиллированной воды до нейтральной реакции водного элюата (рН 6,0-6,5). Собирали фракции элюата объемом 3 мл. Фракции, содержащие альфа-кетометилселеномасляную кислоту, объединяли, к раствору альфа-кетометилселеномасляной кислоты добавляли концентрированную хлористоводородную кислоту до рН 1,9, переносили в делительную воронку объемом 250 мл с притертой пробкой, добавляли 100 мл хлороформа, энергично встряхивали в течение 3-5 минут и оставляли на 5 минут в вертикальном положении для разделения фаз. Нижнюю органическую фазу, содержащую целевое соединение, отделяли, переносили в круглодонную колбу объемом 0,5 л и упаривали на роторном испарителе. После полного удаления органического растворителя получали препарат КМСБ. Структура и содержание КМСБ были подтверждены методами масс-спектрометрии и хроматографического анализа. Выход КМСБ составил 47%.

Пример 4. Синтез и выделение КМСБ

Навеску 1 г L-селенометионина растворяли в 22 мл дистиллированной воды. Доводили рН раствора до 7,4 с помощью 1 М NaOH. Раствор переносили в колбу объемом 1000 мл и добавляли раствор (около 3,5 мл), содержащий 150 мг оксидазы L-аминокислот из Crotalus adamanteus. Начальная концентрация L-селенометионина в реакционной смеси составила 200 мМ, оксидазы L-аминокислот 5,9 мг/мл. Смесь инкубировали при 20°С и перемешивании со скоростью 120 об/мин в термостатируемом шейкере, расположенном в вытяжном шкафу, работающем на максимальной мощности. По завершении ферментативного превращения реакционную смесь центрифугировали при 12000g в течение 30 минут. Надосадочную жидкость депротеинизировали методом ультрафильтрации с помощью центрифужных фильтров с мембраной, ограничивающей прохождение молекул с молекулярной массой более 30 кДа. Ультрафильтрацию проводили при 4°С и 4000g в течение 20-25 минут. Депротеинизированный раствор пропускали через колонку (длина 40 см, диаметр 20 мм), заполненную катионообменной смолой в Н-форме, с помощью насоса высокого давления со скоростью 6 мл/мин и элюировали дистиллированной водой с той же скоростью с термостатированием при 4°С. Ионообменную смолу предварительно активировали последовательным промыванием 500 мл дистиллированной воды, 100 мл 1 М HCl и 500 мл дистиллированной воды до нейтральной реакции водного элюата (рН 6,0-6,5). Собирали фракции элюата объемом 3 мл. Фракции, содержащие альфа-кетометилселеномасляную кислоту, объединяли, к раствору альфа-кетометилселеномасляной кислоты добавляли концентрированную хлористоводородную кислоту до рН 1,9, переносили в делительную воронку объемом 250 мл с притертой пробкой, добавляли 100 мл толуола, энергично встряхивали в течение 3-5 минут и оставляли на 5 минут в вертикальном положении для разделения фаз. Верхнюю органическую фазу, содержащую целевое соединение, отделяли, переносили в круглодонную колбу объемом 0,5 л и упаривали на роторном испарителе. После полного удаления органического растворителя получали препарат КМСБ. Структура и содержание КМСБ были подтверждены методами масс-спектрометрии и хроматографического анализа. Выход КМСБ составил 40%.

Пример 5. Синтез и выделение КМСБ

Навеску 600 мг L-селенометионина растворяли в 28 мл дистиллированной воды. Доводили рН раствора до 7,4 с помощью 1 М NaOH. Раствор переносили в колбу объемом 500 мл и добавляли раствор (около 2,6 мл), содержащий 100 мг оксидазы L-аминокислот из Crotalus adamanteus. Начальная концентрация L-селенометионина в реакционной смеси составила 100 мМ, оксидазы L-аминокислот 3,3 мг/мл. Смесь инкубировали при 18°С и перемешивании со скоростью 120 об/мин в термостатируемом шейкере, расположенном в вытяжном шкафу, работающем на максимальной мощности. По завершении ферментативного превращения реакционную смесь центрифугировали при 12000g в течение 30 минут. Надосадочную жидкость депротеинизировали методом ультрафильтрации с помощью центрифужных фильтров с мембраной, ограничивающей прохождение молекул с молекулярной массой более 30 кДа. Ультрафильтрацию проводили при 4°С и 4000g в течение 20-25 минут. Депротеинизированный раствор пропускали через колонку (длина 40 см, диаметр 20 мм), заполненную катионообменной смолой в Н-форме, с помощью насоса высокого давления со скоростью 6 мл/мин и элюировали дистиллированной водой с той же скоростью с термостатированием при 4°С. Ионообменную смолу предварительно активировали последовательным промыванием 500 мл дистиллированной воды, 100 мл 1 М HCl и 500 мл дистиллированной воды до нейтральной реакции водного элюата (рН 6,0-6,5). Собирали фракции элюата объемом 4 мл. Фракции, содержащие альфа-кетометилселеномасляную кислоту, объединяли, к раствору альфа-кетометилселеномасляной кислоты добавляли концентрированную хлористоводородную кислоту до рН 1,9, переносили в делительную воронку объемом 250 мл с притертой пробкой, добавляли 50 мл бензола, энергично встряхивали в течение 3-5 минут и оставляли на 5 минут в вертикальном положении для разделения фаз. Нижнюю органическую фазу, содержащую целевое соединение, отделяли, переносили в круглодонную колбу объемом 0,5 л и упаривали на роторном испарителе. После полного удаления органического растворителя получали препарат КМСБ. Структура и содержание КМСБ были подтверждены методами масс-спектрометрии и хроматографического анализа. Выход КМСБ составил 49%.

Пример 6. Синтез и выделение КМСБ

Навеску 800 мг L-селенометионина растворяли в 28 мл дистиллированной воды. Доводили рН раствора до 7,4 с помощью 1 М NaOH. Раствор переносили в колбу объемом 500 мл и добавляли раствор (около 2,6 мл), содержащий 100 мг оксидазы L-аминокислот из Crotalus adamanteus. Начальная концентрация L-селенометионина в реакционной смеси составила 133 мМ, оксидазы L-аминокислот 3,3 мг/мл. Смесь инкубировали при 20°С и перемешивании со скоростью 120 об/мин в термостатируемом шейкере, расположенном в вытяжном шкафу, работающем на максимальной мощности. По завершении ферментативного превращения реакционную смесь центрифугировали при 12000g в течение 30 минут. Надосадочную жидкость депротеинизировали методом ультрафильтрации с помощью центрифужных фильтров с мембраной, ограничивающей прохождение молекул с молекулярной массой более 30 кДа. Ультрафильтрацию проводили при 4°С и 4000g в течение 20-25 минут. Депротеинизированный раствор пропускали через колонку (длина 40 см, диаметр 20 мм), заполненную катионообменной смолой в Н-форме, с помощью насоса высокого давления со скоростью 6 мл/мин и элюировали дистиллированной водой с той же скоростью с термостатированием при 4°С. Ионообменную смолу предварительно активировали последовательным промыванием 500 мл дистиллированной воды, 100 мл 1 М HCl и 500 мл дистиллированной воды до нейтральной реакции водного элюата (рН 6,0-6,5). Собирали фракции элюата объемом 4 мл. Фракции, содержащие альфа-кетометилселеномасляную кислоту, объединяли, к раствору альфа-кетометилселеномасляной кислоты добавляли концентрированную хлористоводородную кислоту до рН 1,9, переносили в делительную воронку объемом 250 мл с притертой пробкой, добавляли 50 мл четыреххлористого углерода, энергично встряхивали в течение 3-5 минут и оставляли на 5 минут в вертикальном положении для разделения фаз. Нижнюю органическую фазу, содержащую целевое соединение, отделяли, переносили в круглодонную колбу объемом 0,5 л и упаривали на роторном испарителе. После полного удаления органического растворителя получали препарат КМСБ. Структура и содержание КМСБ были подтверждены методами масс-спектрометрии и хроматографического анализа. Выход КМСБ составил 44%.

Изобретение относится к способу синтеза альфа-кетометилселенобутирата - продукта превращения L-селенометионина. Предложенный способ характеризуется тем, что создают водный раствор аминокислоты L-селенометионина в концентрации от 10 до 200 мМ, доводят рН до 6-9 и проводят превращение под действием биокатализатора - оксидазы L-аминокислот из Crotalus adamanteus, выдерживая реакционную смесь при 10-30°С при перемешивании до достижения максимального выхода альфа-кетометилселенобутирата, депротеинизируют раствор методом ультрафильтрации, пропускают раствор через катионообменную колонку в Н-форме, объединяют фракции, содержащие альфа-кетометилселеномасляную кислоту, экстрагируют целевой продукт органическим растворителем и после удаления органического растворителя получают препарат альфа-кетометилселенобутирата. Технический результат заключается в разработке препаративного синтеза альфа-кетометилселенобутирата в результате превращения L-селенометионина под действием оксидазы L-аминокислот с выходом не менее 40%. 2 з.п. ф-лы, 6 пр.

1. Способ синтеза альфа-кетометилселенобутирата, характеризующийся тем, что создают водный раствор аминокислоты L-селенометионина в концентрации от 10 до 200 мМ, доводят рН до 6-9 и проводят превращение под действием биокатализатора - оксидазы L-аминокислот из Crotalus adamanteus, выдерживая реакционную смесь при 10-30°С при перемешивании до достижения максимального выхода альфа-кетометилселенобутирата, депротеинизируют раствор методом ультрафильтрации, пропускают раствор через катионообменную колонку в Н-форме, объединяют фракции, содержащие альфа-кетометилселеномасляную кислоту, экстрагируют целевой продукт органическим растворителем и после удаления органического растворителя получают препарат альфа-кетометилселенобутирата.

2. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что количество биокатализатора для оптимального превращения определяют эмпирически при отборе проб реакционной смеси в модельном эксперименте, проводимом в малом объеме с соблюдением аналогичных экспериментальных условий и концентраций, и слежении за накоплением целевого продукта.

3. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что в качестве органического растворителя используют гептан, бензол, толуол, циклогексан, четыреххлористый углерод, хлороформ, хлористый метилен или их смеси.