Способ получения питательной среды для производства биомассы @ @ Советский патент 1984 года по МПК C12N1/20 C12N1/07 

ю

4 о ю

QD Изобретение относится к промышленной микробиологии, в частности к получению биом&ссы Bacillus muciloginosus, которая все шире находит применение в различных областях народного хозяйства: в качестве добавки к корму при кормлении Телят, для очистки сточных вод, для получения смазывающего материала, для изготовления бетонных и железобетонных изделий и т.д. Известны питательные среды to на мясной основе: мясопептонный бульон (простой), мясопептонный агар содержащие, мае.%: углерод 18-21, азот 17-21, фосфор 10-12, минеральные вещества 30-35 и другие компоненты t1-25. Недостатками плотных и жидких питательных сред на мясной основе яв ляются их высокая стоимость (1 Л 5 руб. 50 коп.) и дефицитность сьфья Известны питательные среды на ми,неральной основе: среда Матусевича, А-27, А-54 и другие, содержащие мел сахарозу, аппатит, стекляннзпо пудру или железную руду, мясопептонный ага (не более 10%) или агар и другие компоненты C2j|. Недостатками питательных сред на минеральной основе являются многокомпонентный состав, длительность культивирования (4-5 сут), незначительный выход биомассы, большое коли чество отходов отработанной среды. Накболее близким техническим решением к изобретению является исполь зование смеси вермикулита, перлита . и глины в качестве субстрата для выращивания томата при добавлении неббльших доз азота t JТАКИМ образом, известные питатель ные среды, широко применяемые в лабораторной практике, использовать в промышленном масштабе нерентабельно из-за их высокой стоимости, дефицитности или длительного процесса выращивания Bacillus macilaginosus. Поэтому актуальным является поиск более дешевьк основ питательной среды для производства биомассы Bacillus mucilaginosus. Цель изобретения - увеличение выхода целево го продукта и уменьшение себестоимости среды. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения питательной среды для производства биомассы Bacillus mucilaginosus, со292держащей минеральную основу и органические источники питания, в качестве минеральной основы и органических источников питания используют гидролизат вермикулитовой подстилки, употреблявшийся на птицефабрике, содержащий 35,7-36,0 мг % аминоазота, и нейтрализуют его 20%-ным раствором NaOH до рН 7,37-7,6. Средний образец пробы для получения основы питательной среды составлен из 20 отдельных выемок подстилочного материала из разных секций и различной глубины подстилочного слоя. Общая масса подстилки, взятой для приготовления питательных сред, составляла 400 г. Для приготовления основы подстилочный материал после использования, имеющий вид увлажненного сияучего вещества, заливают водопроводной водой из расчета 100 г на 2л воды, зкстрагируют органические вещества в течение 3 ч при комнатных условиях. Затем фильтруют через бумажный фильтр и получают прозрачную жидкость темно-соломенного цвета, которзпо стерилизуют в автоклаве при 1 атм 30 мин. Полученный таким образом питательный субстрат нмел следукнцую характеристику . (табл. Т).. Таблица 1 Водный экстракт из отработанного верми250 37,77 0,798 . кулита Перед опытом рН доводят до 7,5.. . Критерием оценки пригодности среды для культивирования Bacillus шucilaginosus служит количество сухой биомассы, полученной из 100 мл среды.. Для посева используют микробную взвесь слиточной агаровой культуры Bacillus mucilaginosus, содержащую 0,5 млрд. микробных клеток в 1 мл. Все опыты ставят в 3-кратной повторц&сти. Инкубирование проводят при в течение 21 ч. Затем культуральную жидкость центрифугируют при 6 тыс. об/мин в течение 20 мин. Надосадочную жидкость сливают, а осадок высзппивают непосредственно в 11240 29 центрифужных стаканчиках и определяют сухз№) массу. В табл.2 представлены различные способы подготовки основы питательной 1среды. Таблица 2

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПИТАТЕЛЬНОЙ .СРЕДЫ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА БИОМАССЫ BACILLUS MUCILAGINOSUS, содержащей минеральную основу и органические источники питания, отличающийс я тем, что, с целью увеличения выхода целевого продукта и уменьшения себестоимости среды, в качестве минеральной основы и органических источников питания используют гидролиэат вермикулитовой подстилки, упртреблявш1йся на птицефабрике, содержащий 35,7-36,0-мг.% аминоазота, и нейтрализую- его 20%-ным раствором NaOH до рН 7,37-7,6... сл с

Состав среды

Опыт

Экстракт из подстилки Экстрагирос добавкой 0,5%

сахарозыТо же

с добавкой МПБ

Гидролизат из подстилки Кислотный

То же, разведенный водой

до содержания в среде

36,0 мг % NHgТо же

Гидролизат из подстилки

Как видно из табл.2, граничные значения выхода биомассы находятся в прямой зависимости от разных факторов: от методики приготовления средн (экстрагирования или кислотного гидролиза); от добавки в среду дополнительных компонентов (сахарозы или мясопептонного бульона); от кратности т спользования среды (одно- или пятикратно); от разведения среды водои.

Эти зависимость имеет большой диапазон, о чем можно судить по выходу биомассы со 100 мл среды, он состоит в пределах от 20 до 285, мг.

Штательная среда, приготовленная по данному способу, может быть использована для ползгчения биомассы при культивировании различных штаммов Staphilococcus aureus. Wood, Ga Cowen и т.д. ,Staph15coccus alleur UE. coli. Другие виДы микроорганизмов не изучались, так как в основе

Граничный

Кратность

приговыход сухой использоваиябиомассы со ния среды 100 мл среды, мг

Однократное 20-30 вание

40-50

То же 40-50

45-100

гидролиз

-- . 30-56 Пятикратное 210-285 - -230-270

технического решения речь идет о создании дешевой питательной среды для производственных целей получения биомассы Bacillus mucilaginosus. Штаммовая принадлежность Bagillus mucilaginosus состояла из штамкоа: ВКМВ-1446-Д, ВКМВ-1452-Д, ВШВ-1462-Д, ВКМВ-1451-Д, М-2 и А. : П р и м е р 1. 100 г использованного вермикулита (подстилочного материала) заливают 2 л водопроводной воды. Эту смесь экстрагируют при 4 С двое суток.

Аминный азот смеси равен . 44,32 мг, %. К этой смеси дабавляют 1,5%-ную НС1 (рН 1,3; 30 мл на 2 л смеси). Режим гидролиза: 30 мин обогрев и 30 мин автоклавирование ри 1 атм. Смесь после гидролиза нейтрализуют 20%-ным NaOH до рН 7,3 фильтруют. Полученный таким образом субстракт имеет следующую харакеристику (табл. 3).

Таким образом, при обьгчном экстрагировании аминоазота было 37,77 мг %, а гидролиз позволяет получить 68,63 мг %, т.е. в 1,9 раз больше.

Все остальные операции по изучению эффективности кислотного гидролиза проводят аналогично примеру 1.

Полученные данные представлены в табл. 4.

Таблица 4

Сухая масса

Состав среды

мг и количество,

мл

Среднее арифметическоетрех опытов 35 1 (контМясопептонныйбульон 100 роль) Гидролизат 100 100 Гидродизат 50 50 Дистиллированная вода 50 Гидролизат 25 Дистиллированная вода 75 45

Из табл. 4 видно, что гидролизный субстрат во всех указанных опытах дает выход биомассы Bacillus mucila,ginosus в 2-4 раза больше в сравнении с контролем.

Пример 2. Исходный кислотный перевар доводят как и в примере 1

Таблица 3

до рН 7,3 и разводят таким образом, чтобы содержание аминного азота составляло 36,0 мг %. Длд этого берут 554 мл КИСЛОТНОГОперевара, добавляют 456 мл водопроводной воды и 1 г NaCl, все остальные операции аналогичны.

Результаты опытов представлены в табл. 5.

Таблица5 1( рол 2 3 4

В рецепт среды не вводится дополнительно NaCl, а в примере 2 она вводится дополнительным компонентом.

Обусловлено это тем, что среды, Полученные экстрагированием и кислотным гидролизом, содержат большое количество хлоридов (табл.1 и 3). : Мясопептонный бульон 100 30 Кислотный перевар 100 30 Кислотный перевар 100 и 0,5 г сахарозы 46 Кислотньп перевар 80 56 Мясопептонный бульон 20

711

Пример 2 отличается тем, что полученный гидролизат разбавляют водой (554 мл 1сислотного перевара +456 мл водопроводной воды). Такое разведение уменьшает количество хлоридов, которое и компенсируется добавочным введением NaCl.

В примере 3 NaCl не добавляли изза того, что в полученном гидролизате содержалось 1,105% хлоридов (табл4 6).

Для культивирования Bacillus muciloginosus можно было и в примере 3 добавить NaCl, так как они относятг ся к галофитам и их оптимальная граница к NaCl лежит впределах 1-2%, при наличии в среде больше или меньше этой концентрации NaCl оказываТаким образом, при кислотном гидролизё; с увеличением времени гидролиза содержание аминоазота в гидролизате увеличилось, т.е. увеличилась степень расщепления до 18,56% что позволяет получить питательного субстрата в 2,2 раза больше в сравнении с обычным экстрогированием. Исходный кислотный гидролизат (перевар) доводят до рН 7,55 и разводят таким образом, чтобы содержание аминоазота составляло 35,34 мг % для этого берут 455 мл кислотного гидролизата и добавляют 545 мл водопроводной воды, NaCl не добавляют. Все остальные операции по изучению эффективности гидролизата проводят как указано в примерах 1 и 2.

ет влияние на количество получения биомассы.

Но большинство микроорганизмов не является солелюбивыми и повышение

концентрации NaCl сказывается на рост и размножение.

Пример 3. Навеска отработанного вермикулита (подстилочный материал) составляет 200 г. Ее зали-вают 4 л водопроводной воды, т.е. соотношение сухого вещества к воде такое же, в предыдущих примерах. Аминоазота р вытяжке 33,18 мг %, Смесь после гидролизата нейтрализуют 20%-ным NaOH до рН 7,55 и

фильтруют. Полученный таким образом питательный субстрат имеет следующую характеристику (табл. 6).

Таблица 6

Дополнительной операцией является то, что на этой среде проводят культивирование не разовое, как указано в примерах 1-3, а одну и ту же среду используют пятикратно, т.е. после 21 ч, культивирования биомассу осаждают центрифугированием, высушивают и определяют сухую массу, а надосадочную жидкость вкось засевают культурой Bacillus mucilaginosus и инкубируют, так повторяют пятикратно. После 5-го культивирования от 100 мл исходной среды остается 50 мл, такой расход среды не позволяет проводить дальнешее сравнительное исследование.

Полученные результаты представлены в табл. 7. 1 . (контроль) Мясопептонный бульон 100 20 2Кислотный перевар 100 30 3Кислотный перевар 100 0,5 г сахарозы 80 4Кислотный перевар 80 и мясопептонньй бульон 20 65

Культивирование совпало с выходными днями, экспозиция 48 ч.

Пример 4. Для многократного использования кисЛотйого перевара , описанного в примере 1, все операции проводят аналогично примеру 3, без добавок в кислотный Ьидролизат. После 5-го культивирования от исзфдной too ил среды остается 50 мл

100

70 50

56,6

100

100

50

Таблица 7

что не позволяет проводить дальнейшее сравнительное исследование. Остаточный аминоазот еще высокий 66,36 мг %, но происходит понижение рН 5,3.. .

Результаты полученных данных представлены в табл. 8.

.Таблица8

40 50

.

40,0

46,6

100

90 100 70

к

Культивирование 48 ч.

Приготовление питательных сред (субстрата) для культивирования Bacillus muciloginosus во всех опытах (из вытяжки и кислотных гидролизатов) проводилось по минимальному соде| жашао в них аминоазота, которое равнялось 35,77 - l56,0 мг %, jp.e. почти в 3 раза меньше.

270 54

20 20 20 260 52

20 230 46

;чем в пительном бульоне Хоттенгера..

Многократное культивирование на предлагаемой среде (пример 4 и 5) позволяет значительно повысить количество выхода биомассы без дополни тельных расходов на приготовление питательного субстрата.