Штамм гриба @ @ 3 @ -106-продуцент целлюлазы Советский патент 1984 года по МПК C12N9/42 C12N15/00 C12R1/645 

1М Изобретение относится к микробиологической промьпплейности, к производству ферментных препаратов, может быть использовано для получения глюк зы для кормовых и пищевьпх: целей из целлюлозосодержащих отходов. Известен штамм Geotrichum candidu 3с, характеризующийся тем, что он вьщеляет в среду активный комплекс ферментов, состоящий из С ферментов (1,4-В - 33. -глюканцеллобиогидролазы ЕС 3.2.t.4) , эндо-1., -глюканаз 1,4- Я -о-глюкан-4-глюканогидролазы ЕС 3.2.1.4) и|5 -глюкозидаз 3.2.1.21) , способных расщеплять нативную высокоупорядоченную форму, цеЯЗйблозы до растворимых сахароз с преобладанием глюкозы (70% от коли .честна всех образующихся восстанавливаемых Сахаров) . Однако указанный штамм обладает недостаточно высокой способностью к образованию ферментов ц ллюлолитического комплекса. Известен также продуцент целлюлазы Trichoderma reesei 139, синтезирующий комплекс целлюлолитических ферментов при глубинной ферментации Ci фермент Гцеллобисгидрола за) и эндо-1, -В-глюканаз. При этом активность Cj фермента по хлопку 7-8 мг/мл(о,8-0,9 ME (.MJ, по бумаге 14-16 мг(шь 1,3-1,40 МЕ(мл|, активность зндоглюканазы по«Ма-карбоксиметилцеллюлозе 200-250 мг(мл)-37,046,3 МЕ(МЛ). Оба фермента синтезируются на 6-7 сут. роста культуры; 2. i Однако известный продуцент целлюлазы не может использоваться для гидролиза целлюлозы с образованием глюкозы без дополнительного внесения препаратов целлобиазы. Известно, что в результате совместного действия эндо-1,4-и-глюканаз и целлобиогидро лаз образуется преимущественно целлобиоза. 3 отсутствии целлобиаз или при наличии их в небольшом количестве происходит неполное расщепление Целлюлозы. Таким образом, известный продуцент, не образующий целлобиазы, имеет, ограниченную возможность практического использования. Целью изобретения является получение нового штамма - продуцента цехшюлазы мутанта Geotrichum cSindidu 3с с повышенной способностью к образованию ферментов целлюлолитического комплекса при глубинном способе культивирования. 7 Цель достигается многоступенчатой селекцией щтамма Geotrichum candidum 3с по признаку образования целлюлазы. В качестве мутагена используется N -нитрозометилбиурет в концентрации 0,2% при времени зкспозиции 2 и 3 .4. Вьщеленный активный мутант Geotri- , humcandidum Зс-106 хранится в коллекции Центрального музея промышленных микроорганизмов института ВНИИгенетика, коллекционный номер -220. . . . Полученный штамм подвергали проверке на активность целлюлазы при хранении и пересевах на свежую питательную среду. Морфологические признаки. Мутант Geotrichumcandidum 3c-106 имеет на всех средах стелющиеся, слабо свптированные гифы, спороносные гифы короткие, прямостоящие или приподнимающиеся, септированные. Конидии образуются по типу артроспор, коротко цилиндрические с обрубленш 1ми концами(5-10 4 мк), бесцветные в цепочках. В агаровых мазках на 5 и 7 сут роста субстратный мицелий состоит из широких Гиф со слабобазофильной цитоплазмой и большим количеством метахроматика в клетке. Гифы воздушного мицелия тоньше, базофилия циФоплазмы сильнее, клетки ТИф также содержит метахроматин. На 10 сут роста часть гиф субстратного мицелия распадается на короткие обрывки (фрагменты)размером 8-10 3,3jl. Концевые участки гиф воздуищого мицелия распадаются на споры и проспоры - конидии, размеры которых . достаточно сильно колеблются: 6,6.3,2.1Ц и 5,9-3,2fu , 6,,9|11 реже 3,6 3,2р| . Конидии слабо искривле;ны. Особенностью штамма Зс-106 является образование на 10 сут роста большого количества встречных гиф - мостиков, образующих анастомозы. Культуральные признаки. Мутантный штамм Зс-106 на среде с :усло-агаром образует колонии (45-50 мм)со слабо выраженной зональностью, белые, паутинистые. Обратная сторона колонии кремовая. Пигмента нет. Эксудата нет. На среде Чапека колони мутанта Зс-106 небольшие (l 2-15 мм), кремовые, малоспорулирующие, радиальноскладчатые с па гтинистым краем. Обратная сторона светло-кремовая. Пигмента нет. На среде Чапека-Дркса колонии гладкие, кремовые, паутинистые, аспорогенные, в центре белые опушенные, размером 24-26 мм. Обратная сторона колонии кремовая с оранжеввия центром. Пигмента нет. На среде Райстрика колонии мелкие кремовые, малоспорулирующие, с сильной радиальной складчатостью. Обратная сторона кремовая. Пигмента нет. На агаризованной среде с бумагой | фильтровальная бумага 1%, пшеничные обруби 2%; (Ш) 80,0,15%; .0,15%; 0,l%;MgS04 0,05%) ,колонии Geotrichum candidum Зс-106 имеют размер 23-25 мм, белые, войлоч ные, с более опушенным центром. Край колонии бесцветный, паутинистый. Обратная сторона желтовато-кремовая. Пигмента нет. На агаризованной среде с кристаллической целлюлозой (целлюлоза 1%:, экстракт отрубей 30%; (NH4)2SO4 NaNO 0-15%; КН„РО 0,1%; MgS04 0,05% колонии крупные(40-45 м1, бесцветные, паутинистые, с широким зональным краем. Центр колонии войлочный, обратная сторона бесцветная, в центре коричневая. Пигмента нет. Биохимические признаки. Штамм Geotrichum candidum Зс-106 активно ассимилирует галактозу, ксилозу, арабннозу, сахарозу, рамнозу, маннит несколько медленнее глюкозу, мальтозу, лактозу, сорбит, инозит, слабо ассимилирует рафинозу Мутант 3c-rl06 не разжижает желатин, не пентонизиpyet молоко, крахмал гидролизует. Использует нитратную и аммонийную формы азота. П р и м е р. Штамм Geotrichum с§п didum Зс-106 выращивали глубинным способом при 28 С на среде состава,% пшеничные отруби 2 свекловичный жом 2; (NHi()040,15; NaN050,15; KHbPOjfO,; MgSO 2HjjO 0,05 . Посевным материалом может служить водная суспензия конидий или миЦелиальная культура двухсуточного возраста.. Посевной материал вносят в количестве 5% по объему. Наибольший уров ень активности наблюдался на 72-96 ч роста культуры. Активность эндо-1,4- Ь-глюканазы в фильтрате культуральной жидкости Geotrichura candidum Зс-106 определяли по падению вязкости растворов Not -карбоксиметилцеллюлозы в минуту. Активность целлобиогидролазы определяли по модифицированному методу Мандельр и Вебера. В настоящее время для определения активности целлобиогидролазы используют метод Мандельо Н Вебера с опре,деленными изменениями. По Мандельо и Веберу активность определяют при , в модификации Фениксовой и др. - при 40 С. Известно, что при повьш1ении температуры скорость реакции возрастает и, следовательно, значения активности бvдyт вьш1е. За единицу активности целлобиазы принимали количество фермента, расщепляющее 1 мкМ целлобиазы за 1 мин при 40°С. В таблице 1 приведены сравнительные характеристики двух культурпродуцентов . Как видно из таблицы, оба продуцента синтезируют Cj-фермент примерно на одном уровне активности, а фермент эндоглюканазу известный продуцент образует в большем ; честве, но не синтезирует фермент целлобиазу. При этом синтез ферменfOB происходит в различные сроки. Таким образом, преимуществом предлагаемого продуцента является его способность образовьшать целлю- i политическую систему из трех ферментов с активной целлобиазой на 3-4 сут роста культуры в отличие от известной культуры, синтезирующей только два фермента в более поздание сроки, на шестые сутки роста. Культуру Geotrichum candidum можно применять для гидролиза целлюлозосодержащих отходов с целью получения гидролизатов глюкозы. Предлагаемый продуцент существенно отличается от цветного спектррм синтезируемых ферментов и скоростью ,их синтеза. При использовании ферментной системы с целлобиазой Geotrichum candidum Зс-106 гидролиз целлюлозосодержащих отходов идет с образованием глюкозы. Полученное гидролизатЫ, содержащие глюкозу, могут использоваться для выращивания кормовых дрожжей, получения этанола и глюкозы.

Целлобиогидролаза

по бумаге 14-16

по хлопку 6-8

Эндо-1,4-р-глюканаза200-250

(осахаривающая)

Деллобиогидролаза

по бумаге 8-10

по хлопку 3-4

Эндо-1,4-(3 -глюканаза Хвискози- 30-60

метрическая),ед/мл

Целлобиаза,ед/мл

6-7

3-4

04

Штамм гриба Geotrichum candidum 3с-106 ((коллекция Центрального музея промьшшенных микроорганизмов Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции микроорганизмов, коллекционный номер ЦМПМ 1 -220/ - продуцент целлюлазы.