Штамм гриба АLLеSснеRIа теRRеSтRIS - продуцент целлюлаз Советский патент 1991 года по МПК C12N9/42 C12N1/14 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению целлюлаз микробного происхождения, используемых в процессе осахаривания целлюлозы.

Цель изобретения - получение штамма гриба Allescheria terrestris ВКПМ F-364 (Н-1) - продуцента термостабильных с более высокой активностью целлюлаз, катализирующих превращение целлюлозы в глюкозу и работающих в оптимальном диапазоне рН 4,5- 4,6.

Штамм A.terrestris H-l получен в результате ультрафиолетового облучения исходного штамма Allescheria terrestris дозой 20 Дж/м21.

Культурально-морфологические признаки. Культура хорошо развивается на 8%-ном кислом сусло-агаре с полоской фильтровальной бумаги на поверхности скошенного агара, на видоизмененной твердой среде Чапека (0,22% пептона вместо NaN03), на модифицированной твердой среде Чапека-Докса с добавлением кукурузного экстракта и полоской фильтровальной бумаги на поверхности агара.

Кислый 8%-ный сусло-агар, рН 4,5, колония быстрорастущая, мииелий плот- нопушистый, белый, обратная сторона колоний бесцветная, гифы тонкие, ровные, гладкие, диаметром 4-5 мк, спороношение очень обильное, кони05Јь

ОО

с&

о

00

диеносцы простые, как правило, оди- ночные, конидии чаще круглые диаметром 4,3-5,0 мк, удлиненные, обратно грушевидные, размером 3-3,5x5-6 мк,

Физиологе-биохимические признаки Штамм хорошо усваивает лактозу, глю- козу, ксилозу, галактозу, крахмал, маннит Не усваивает рамнозу, рафи- нозу, маннозу и сорбит Из источни- ков азота хорошо усваивает органические и неорганические соединения азота. Наиболее интенсивный рост наблюдается на нитратах Усваивает разнообразные фосфорные соединения, однако более интенсивно одно- и двух замещенный фосфорнокислый калий Штамм высокие эндоглюканазную (экдо- -1,4#-глюканаза) и целлобиазну.ю активности выявляет в пределах рН 4,5- 4; 6 Оптимальная температура для роста и биосинтеза 40°С Штамм гидро- лизует целлюлозу (разные целлюлозные субстраты) Наблюдается эндоглюка- назная и высокая целлобиазная актив- ности на среде, содержащей микрокристаллическую целлюлозу ЛТ в качестве единственного источника углерода.

Целлюлаза данного штамма термо- стабильна, после ведения ферментативной реакции при 70°С в течение 3 ч активность почти полностью сохраняется.

Для размножения штамма применяют 8%-ный кислый сусло-агар с полоской фильтровальной бумаги на поверхности скошенного агара, рН среды 4,5

Посевным материалом служит 10-ти суточная культура штамма. Для полу- чения целлюлаз используют жидкую питательную среду следующего состава г/л: KHfcPO. 6,8; (NH4)S04 1,3; MgS04 7Hj 0 0,5; микрокристаллическая целлюлоза ЛТ 1%; СаС12 0,2; пептон 1,5; кукурузный экстракт 1,5%, рН среды 5;5

150 мл питательной среды в кони- ческих колбах емкостью 750 мл сте- j рилизуют 40 мин при 1 ати Максимальная активность целлюлаз отмечается ; при выращивании штамма на термоста- ; тированной качалке, делающей 220 об/, /мин, при 40°С в течение 96 ч Активность биосинтезируемой штаммом целлюлазы следующая, ед/мл: по NaKMU, 5,8; по фильтровальной бумаге 0,5; по целлобиозе 1,5

Q 5 0 5

Q

,.

о

0

5

Эндоглюканазную активность целлит- лазного комплекса определяют виско- зиметрическим методом, в основе которого лежит определение начальной скорости уменьшения относительной вязкости раствора карбоксиметилцеллкг лозы при добавлении культуральной жидкости

Для определения активности по NaKMU. 1 мл 1,5%-ного раствора субстрата в 0,05 М ацетат ном буфере (рН 4,7) и 1 мл культуральной жидкости инкубируют в течение 30 мин при 60°С За единицу активности принимают количество фермента, образующее 1 мкмоль восстанавливающих Сахаров при 1%-ной концентрации субстрата в минуту. Количество восстанавливающих Сахаров определяют по методу Сомоджи-Нельсона

Для определения активности по фильтровальной бумаге 50 мг фильтровальной бумаги Ватман № 1 (1x6 см) в 1 мл 0,05 М ацетатного буфера (рН 4,7) и 1 мл культуральной жидкости инкубируют в течение 1 ч при 55 С За единицу активности принимают количество фермента, образующего 1 мкмоль восстанавливающих Сахаров в минуту Количество восстанавливающих Сахаров определяют.по методу Сомод- жи-Нельсона

Для определения целлобиазной активности 0,2 мл М целлобиозы, 1,6 мл 0,05 М ацетатного буфера (рН 4,7) и 0,2 мл раствора культуральной жидкости инкубируют в течение 10 мин при 55°С. За единиц активности принимают количество фермента, образующее 2 мкм глюкозы (проводят глюкозооксидазным методом).

Кроме высокоактивных целлюлаз, продуцент образует богатую белком (35-40%) биомассу.

Пример 1 Штамм Allescheria terrestris. H-1 выращивают на агари- зованном 8%-ном кислом сусло-агаре с подоской фильтровальной бумаги на поверхности агара, рН среды

Культивирование проводят в течение 98 ч при 40°С Суспензией спор, полученной смывом с указанной среды, засевают колбы емкостью 750 мл, содержащей 150 мл среды следующего состава, г/л: микрокристаллическая целлюлоза ЛТ 1,0%; (. 1,3; пептон 1,5%; КНаР04 6,8; MgS04-7 0 0,5; CaCl-2 0,2; кукурузный экстракт

1,5%; pH среды 5,Ь. Выращивание культуры проводят на круговой качалке, делающей 220 об/мин при 40° С в течение 96 ч. Биомассу отделяют фильтро- ванием и в культуральной жидкости определяют активности целлюлаз по указанным методам. Активность биосин- тезируемой штаммом целлюлазы следую- щая, ед/мп: по эндоглюканазе 3,3; по NaKMU 5,8; по фильтровальной бумаге 0,5; по целлобиазе 1,5.

При выдерживании препарата при в течение 3 ч активности целлнг- лаз почти полностью сохраняются

Способность штамма расти при повышенной температуре (40дС) ограничивает возможность заражения посторонней микрофлорой.

64J

10

15

086

Получены опытные партии целлюпаз Allescheria terrestris H-l в двухсот- литровых и двухкубовых ферментерах.

При выращивании на лигно-целлкг лоэных отходах пищевой промышленности и сельского хозяйства штамм Allescheria terrestris H-l образует богатую белком биомассу и может служить источником белка для кормления крупного рогатого скота и птиц. В научных целях, в особенности в генной инженерии, целлюлазы указанного штам ма могут быть применены для разрушения клеточной стенки. Формула изобретения

Штамм гриба Allescheria terrestris ВКПМ F-364 - продуцент целлюлаз.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению нового продуцента термостабильных целлюлоз. Цель изобретения - получение штамма гриба Allescheria terres- tris ВКПМ F-364 (H-l) - продуцента термостабильных целлкшаз с более высокой активностью, катализирующих превращение целлюлозы в глюкозу и работающих в оптимальном диапазоне рН 4,5-4,6. Изобретение позволяет получить целлюлазы, в частности эндо- глюканазу - 3,3 ед/мл, целлобиазу - 1,5 ед/мл, активность по NaKMU. - 5,8 ед/мл, активность по фильтровальной бумаге - 0,5 ед/мл. Ферментный препарат, выделенный из Allescheria terrestris H-l, обладает термоста- бильностью. Штамм быстрорастущий. Растет на синтетических средах, признаки штамма устойчивы. Образует богатую белком биомассу (35-40 мас.%). Для получения целлюлаз используется сравнительно дешевая синтетическая среда. (Л