Способ определения экдистерона в культуральной среде Советский патент 1984 года по МПК C12Q1/32 

:о э

Изобретение относится к сельскому хозяйству и биологии и может быть использовано в практических целях в качестве экспресс-тест-системы для биологически активных веществ.

Известен способ определения экдистерона в культуральной среде посредством пуффинга хромосом слюнных яселез Drosophila virilis. Личинок (30-40 шт.) отбирают из массовых культур в момент 2-й линьки на 48-м часе III -го возраста, вьщеляют из них слюнные железы и переносят в культуральнуго среду С-50 химически определенного состава, культивируют железы в ней 0,5-24 ч в бюксах или пеницеллиновых флаконах, содержащих 1 мл среды С-50 без гормона или с гормонами насекомых. Затем железы переносят в 1%-ный раствор ацет.о орсеина на 2 ч при 22°С или 12-14 ч при 10-14°С, после окрашивания же лез готовят давленные препараты их по рутинному способу и проводят , кариологический анализ дистальной части железы (10 шт.), просматривая экспрессию спектра пуфов в десяти яд рах калодой из желез. На каждом из сроков анализируют-в среднем 12200 районов хромосом в среде С-50, 12400 районов - в среде с ювенилЬпым гормоном, 12200 - в среде с эк.дистероном. Всего анализируют в среднем 36800 районов хромосом в

следний проводят в индикаторных участках хромосом с первичной реакцией на экдистерон и по наличию ре-, акции в участках Х-А-6, 2-Д-З, З-С-1, 3-G-2, 4-С-4 судят о наличии в среде экдистерона.

П р им е р. Отбирают личинок Drosophila virilis во время 2-й линьки. Выделяют слюнные железы из личинок 48-го часа ПГ -го возраста в О,6%-ном растворе NaCl. Переносят в бюксы (диаметр 25 мм, высота 25 мм) с 1 мл среды С-50 составы (концентрация веществ в мг/100 мл трижды

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭКДИСТЕРОНА В КУЛЬТУРАЛЬНОЙ СРЕДЕ, предусматривающий вьщеление из личинки Drosophila virilis последнего личиночного возраста слюнной жгелезы, ее вьщерживание в испытуемой культуральной среде пр.и 20-22°С,приготовление давленного ацетоорсеинового препарата этой железы с последующим анализом спектра пуфов хромосом, о т.лича(щийся тем, что, с целью сокращения определения, анализ спектра пуфов проводят ,в индикаторных участках хромосом с первичной реакцией иа экдйстерон и по . наличию. реакции в участках Х-А-6,. 2-Д-З, З-С-1, 3-0-2, 4-С-4 судят о наличии в среде экдистерояа.

Недостатком известного способа является то, что кариологический анализ его продолжителен, сложен и трудоемок, так как включает в себя спектр пуфов всего генома, большинство из которых реагируют на экдистерон неспецифично, т.е. чувствительны как к экдистерону, так и к юзенильному гормону. Цель изобретения - сокращение времени определения. Указанная цель достигается тем, что согласно способу определения экдистерона в культуральной среде, предусматривающему вьщеление из личинки Drosophila virilis последнего личиночного возврата слюнной железы ее выдерживание в испытуемой культуральной среде при 20-22 С, приготовление давленного ацетоорсеиновог препарата этой железы с последующим анализом спектра пуфов хромосом, по Глюкоза 300,0 Эмбриональная телячья сыворотка 5%-ная рН 6,9 + 1 мг/мл экдистерона Serva, ФРГ. Культивируют железы в течение 30 мин при 20-22с в герметических условиях. Окрашивают в 1%-ном растворе ацетоорсеина в течение 2 ч при 20-22°С или 12-14 ч при 10-14 С. Готовят давленные препараты желез,, для чего переносят железу из краски на предметное стекло, краску удаляют; помещают в каплю насыщенного раствора хлоралгидрата (5 г в 2 мл воды); бьютро (через 3-4 с) смывают его 45%-ной уксусной кислотой; помещают железу в каплю 50%-ной молочной кислоты; покрывают покровным стеклом, прижимая его к предметному стеклу.

Проводят кариологический анализ пяти индикаторньЬс пуфов в районах Х-А-6, 2-Д-З, 3-C-t, З-а-2, 4-С-4, по экспрессии которых судят о наличии экдистерона в культуральной среде. В среде без экдистерона индикаторные пуфы не формируются.

Таким образом, предлагаемый спо соб определения экдистерона в культуральной среде посредством пуффинга индикаторных участков в политенных хромосомах Drosophila virilis

технически прост, сокращает продолжительность анализа в 15 раз (анализ по предлагаемому способу продолжается 1 день, по известному - 15 дней). Объем анализируемого материала сокращается в 73 раза(по предлагаемому способу анализируют 500 участков хромосом, по известному 36800 участков).

Разработанный способ определения экдистерона в культуральной среде позволяет использовать индикаторные районы на экдистерон всех насекомых, обладающих тканями с политенным кариотипом.