Биологический способ определения экдистерона в теле насекомого Советский патент 1984 года по МПК C12Q1/32 

. Изобретение относится к сельско хозяйственной, медицинской и лесной энтомологии и биологии, а именно к методам биологической борьбы с вредными насекомыми и может быть использовано в сельском и лесном хозяйстве, а также в медицине в качестве экспресс-тест-системы дл определения биологически активных веществ. В настоящее время с целью охраны биосферы исследуются возможности использования биологических методов борьбы с нaceкo в lми-вpeдитeлями, Одним из таких подходов может бмть использование гормонов насекомых для регуляции численности популяций уничтожаекшх вредителей, для чего необходим способ определения наличи и биологической активности гормонов на разных стадиях развития особей. Для определения зкдистерона одного из аналогов гормона линьки Н секомых зкдизона - известен способ наложения лигатур, который заключа,ется в том, что личинок насеког-опс перевя зывают до склеротизации кутик лы в передней трети тела и по окукл ванию отшнурованных. сегментов судят о наличии гормона в них п . Известен также способ Каллифора тест, технически более сложный чем способ наложения лигатур. Он основан на экстракции экдистерона из гомогената :.анализируемого насекомого метанолом, бутанолом и петралейным эфиром. Конечный продукт экстракции после многократного реэкстрагирования инъецируют личинкам Каллифора в брюшной отдел за лигатурой и по размерам склероти зированной кутикулы в отшнурованп ном сегменте определяют титр экдизо на 2 . Радиоиммунный способ определения экдистерона наиболее сложен. Он включает в себя накопление синхрони зированного материала анализируемой стадии(5 мг сухого веса), который подвергают сложной обработке для антигенного связывания с меченым по гормональным производным, синтез и очистку экдизонового произ водного, получение экдистерон-альбу минового комплекса, которым иммунизируют кроликов и определяют антисывороточную специфичность по техни ке диализа 3J. 002 Однако способ наложения лигатур ограничен личиночной стадией} Каллифора тест требует накопления синхронизированного материала для получет ния гомогената (ю-15 г), а количественная оценка гормона по нему затруд,нена, так как гормон теряется в процессе многократной обработки материала и в нем могут быть примеси, токсичные для реципиента, что снижает надежность способа; радиоиммунный способ трудоемок, технически сложен, продолжителен (анализ по нему длится более 3 , включает в себя работу с высокотоксичными и радиоактивными веществами. Использование его в энтомологической лабора:тории затруднительно. Цель изобретения состоит в повышении точности анализа и сокращении времени его проведения. .Указанная цель достигается тем, что согласно биологическому способу определения экдистерона в теле насекомого производят трансплантацию слюнной железы личинки DrosophiFa viritis в брюшко насекомого, железу инкубируют в насекомом 15-60 мин, извлекают ее из брюшка, готовят давленый ацето-орсеиновый препарат и проводят кариологический анализ тГрепарата, при этом о наличии экдистерона судят по экспрессии пуфов в индикаторных районах. П р и м е р 1. На жуке Tenebrip mofitor(большой мучной хрущак). Слюнные железы личннок Drosophifa virifis, линия Р - 40, на 46-50-м часе Ш личиночного возраста вццеляют в 0,6 Е-ном растворе NaC Е и трансплантируют в брюшко куколок реципиента на разных сроках развития культивируют их 30 мин, затем готовят давленые ацето-орсеиновые препараты хромосом следующим.образом: переносят железу из краски на предме-шое стекло, краску удаляют; помещают железу в каплю насыщенного раствора хлоралгидрата (5 г в 2 мл воды); быстро череэ 3-4 с), смывают его 45%-ной уксусной кислотой; цомещают железу в каплю 50%-ной молочной кислоты; покрывают покровным стеклом, прижимая его к предметному, и проводят кариологический анализ индикаторных районов хромосом, показьшающий, что на стадии 4-дневной куколки в хромосомах слюнных желез присутствуют все пуфыиндикаторы, что указывает на высокое дёодержание экдистерона в гемолимфе куколок жука и пооницаемость гоомона в клетки тоансплантата. Полученные данные хорошо согласуются с литера турными по содержанию экдистерона в процессе развития Tenebrlo moHtor выявленному по радиоиммунному способу . -4 Пример2. На клопе Eurigaste integriceps вредная черепашка). Условия культивирования желез Личино дрозофилы в брюшке этого насекомого/ способ приготовления давленых ацетоорсеиновых препаратов хромосом и кариологический анализ их такие же, как в примере 1. Кариологический анализ индикаторных районов хромосом трансплантата на стадии личинки этого клопа выявил присутствие четких пуфов в конце личиночного возраста(5-дневные личинки Eurigaste У возраста , что говорит о ttpHcyrствии и высоком содержании экдистеро на в гемолимфе этих особей, как.и у Tenebrio (4-дневная куколка, пример i). На стадии имаго самки Eurigaeter в диапаузе пуфов-индикаторов не име ли, как и личинки более ранних . Строков развития, в трансплантатах которых набледали лишь отдельные слабо развитые , что интерпр тируется как резкое снижение содержания гормона в их гемолимфе. Трансплантаты из брюшка яйцекладущих самок Eurigaster имели все пуфыиндикаторы, кроме пуфа 2-Р--3, что свидетельствует о наличии в гемо лимфе незначительного количества гормона, так как пуфы выражены-слабо. Таким образом, данные примеров 1 и 2 достоверно подтверждают возможность определения экдистерона в гемолимфе Ъасекомых-вредителей посредством пуффинга политенных хромосом трансплантата на разных стадиях развития испытываемого насекомого. В качестве трансплантата кроме слюнных желез Dnosophlfa virifis могут быть использованы органы всех насекомых; обладающих т1саиями с политенным кариотипом. Разработанный способ определения экдистерона в теле насекомого посредством пуффинга индикаторных районов хромосом трансплантата может быть использован на всех стадиях развития реципиента, не требует накопления синхронизированного материала исследуемого насекомого, дает возможность определять экдистерон непосредственно в теле насекомого, устраняет noTeiMo гормона в процессе обработки, что суш;ественно повышает надежность способа, сокращает продолжительность анализа до 3 дн.(48 ч - срок развития личинки дрозофилы, ч - кариоло1Рический анализу, исключает многочисленные трудоемкие операции и приме- : нение высокотоксичных и радиоактивных веществ. Техническая простота предлагаемого способа позволяет . использовать его как экспресс-тест на экдистерон непосредственно в полевых условия.

БИОЛОГИЧЕСКИЙ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭКДИСТЕРОНА В ТЕЖ НАСЕКОМОГО, отличающийся тем, что, с целью повышения точности анализа и сокращения времени его проведения в 16рюшко насекомого производят трансплантацию слюнной железы личинки Drosophila viritis, железу 41нкубируют в насекомом 1560 мин, затем извлекают ее из брюшка, готовят давленьй ацето-орсеиновый препарат и проводят кариологический анализ препарата, при этом о наличии экдистерона судят по экспрессии пуфов в индикаторных районах.