Способ выделения фосфоинозитида из соевых фосфатидов Советский патент 1982 года по МПК C07F9/10 

(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ФОСФОИНОЗИТИДА ИЗ СОЕВЫХ Изобретение относится к химии фосфорорганических соединений, а именно к способу выделения фосфоинозитида из соевых фосфатидов, который находит широкое применение в изучении структуры и функции мембран, его роли в нервной ткани, в медицине и фар макологии. Известен способ получения фосфоинозитида, заключающийся в экстракции говяжьего мозга последовательно ацетоном, метанолом, петролейным зфиром, с многократным переосаждением в эфире-ацетоне для получения кефалиновой фракции, которую смешивают с дистиллированной водой и подвергают диализу 4 сут, далее из нее получают фосфоинозитидную фракцию хлороформ-метанольным методом с последующим многократным переосаждением фракции из хлороформ-метанольной смеси, диализом, лиофилизацией, переводом в Na-Соль этилендиаминотетрауксусной кислотой и пропусканием через колонку с Chefex - 100 (Na-форма) и последующим получением фосфоинозитида на колонке с ДЕЛЕ-целлюлозой и дополнительной доочисткой его от фосфатиФОСФАТИДОВдилсерина. Из 850 г мозга получают 217 мг смеси фосфоинозвткда с фосфатидилсерином, что составляет около 0,03% от исходного субстрата 1. Однако способ требует длительной (около 7-9 рабочих дней) и сложной (многократное переосаждение, диализ, лиофилизация, очистка на ионообменной: смоле переведенной в Na-форму фракции) процедуры получения фосфоинозитидной фракции и дополнительной процедуры для отделения фосфоинозитида от фосфатидилсерина. Известен способ вьщеления фракций фосфоинозитидов из ткани головного мозга, заключающийся в получении липидного экстракта петролейным зфиром из мозга, обезвоженного ацетоном, хлороформ- метанолом (1:9), этанолом, растворении липкдов в хлороформ-меганольной системе с добавкой соляной кислоты, перемешивании, центрифугировали и получении фракции кислых фосфолипидов, освобождением липидного экстракта от ионов двухвалентных металлов и фосфолипидов, имеющих основные группы, на Даузкс-50 (Н-форма), с последую395щим делением фракили на ДЕАЕ-целлюлозе для удаления полифосфоинозитидов и получении фракции, содержащей монофосфоинозинш, с последующим переводом ее в Naформу на колонке с Дауэкс-50 (Н-форма) и дальнейшим разделением на для получения монофосфоинозитида в Na-форме. Моно фосфоинозитид дочищают от возможных примесей петролейным эфиром или изопропиловым спиртом. Из 1 кг ткани головного мозга получают 1 г фосфоинозитида, т.е. около 0,1% от исходного субстрата 2. Недостатками этого способа являются его трудоемкость и многостадийность при получении фосфоинозитидной фракции для последующего хроматографи 1еского разделения - зкстракция ацетоном, хлороформ-метанол ом, этанолом, петролейным эфиром, получение фракции кислых фосфолипидов на Дауэкс-50 частичная очистка их на ДЕАЕ-целл|юлозной колонке, перевод в Na-форму на кoлoнke с Дауэкс-50 и дополнительная доочистка про дукта от возможных примесей. Выход конечного продукта относительно невысок. Наиболее близким по технической сущности и достигаемым результатам к предлагаемому является способ выделения фосфонозитида из соевых фосфатидов путем последовательной экстракции фосфолипидов хлороформом и метанолом с последующей хроматографической очисткой на силикагеле. Из 5 г фосфолипидо этим способом получают 200 мг делевого продукта 3. Недостатком этого способа является невысокий выход целевого продукта. Цель изобретения - увеличение выхода целевого продукта. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу выделения фосфоинозитида из соевых фосфатидов, соевые фосфатиды подвергают последовательной экстракции ацетоном и хлороформ-метанолом, отмывают экстракт водой, смещивают его с окисью алюминия в весовом соотношении 1:8 р подвергаю очистке на колонке с сухим смещанным сорбентом - смесью силикагеля с диэтиламиноэтилцеллюлозой, взятых в весовом соотнощен 1:1. Предлагаемый способ позволяет увеличить выход целевого продукта до 80% от исходного количества фосфоинозитида в соевых фо фатидах или 2,6% от исходного количества субстрата. Пример 1. Получение фосфоинозитид из коммерческих соевых фосфатидов. Получение экстракта. 50 г коммерческих соевых фосфатидов отмывают от нейтральных липидов ацетоном 5 раз (фосфатиды-растворитель 1:5), остаток кстрагируют 1 раз хлороформ-метанолом (1:1) (фосфатиды-растворитель 1:10). Хлороорм-метанольный экстракт отмывают дистилированной водой (1/5 часть от объема экстракта). Водный слой отбрасывают. хлороформ-метанольный слой используют для вьщеления фосфоинозитидной фракции. Из 50 г коммерческих фосфатидов получают 24 г общих ЛИПИДОВ, из них фосфолипиды составЛяют 59%. В состав фосфолипидов входят,%: фосфоинозитид 12; фосфатидилэтаноламин 29,5; фосфатидилхолии 36,7; фосфатидная кислота 8,8; фосфатидилглицерин 2,3; полиглицерофосфатиды 2,2; дифосфатидилглицерин 2,2; дифосфоинозитид 1,7; лизофосфатидилхолин 2,1%. Выделение фосфоинозитидной фракции. Общий липидный экстракт доводят до концентрации 30 мг/мл хлороформ-метанолом 1:1 (24 г общих липидов растворяют в 720 мл системы), смешивают с 200 г окиси алюминия (L 40/250 и , щелочной, для хроматографии, Чехословакия; соотношение сорбент : линиды 8:1), выливают в воронку Бюхнера и элюируют лецитиновую фракцию 3,6 л хлороформ- метанола (1:1), отсасывая ее вакуумным , на-, сосом в колбу Бунзена. Фракцию отбрасывают. I Фосфоинозитидную фpakцию (фосфоинозитид, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилглицернн, полиглицерофосфатиды, дифосфатидилглицерин, |дифосфоинозитид и гликолипидь) элюируют 12 л хлороформ-метанола (1:1) с добавкой 15% от объема 1%-ного водного уксуснокислого аммония (фосфатидная кислота этой системой не элюируется). К полученной фракции добавляют 1/5 часть дистиллированной воды. После отстаивания верхнюю водную фазу отбрасывают. Нижнюю хлороформную фазу концентрируют досуха на роторном испарителе. Выход фракции 6,38 г. Выделение фосфоинозитида. 5 г фосфоинозитидной фракции растворяют в 80 мл хлороформа, смещивают с 40 г силикагеля марки L 100/250 д (Чехословакия), высущивают на роторном испарителе до сыпучего состояния и засыпают на сухую колонку со смещанным сорбентом - ДЕАЕ-целлюлоза с силикагелем в соотношении 1 г исходной фосфоинозитидной фракции на 80 г сорбента. Подготовка колонки. ДЕДЕ-целлюлозу (бисерный полимер, анионит, Венгрия) предварительно замачивают на 30 мин в 1 н. НСЕ промывают последовательно 1 н, раствором НС6 водой и 1 н.. раствором гидроокиси натрия, трижды повторяют такую обработку, тщательно промывают один раз метиловым спиртом, помещают в ледяную уксусную кислоту на 1 сут, после чего отмывают метанолом до нейтральной рН. К гото5вой ДЕЛЕ-целлюлозе в метаноле добавляют равное количество силикагеля марки Л 40/100 (Чехословакия), хорошо перемешивают и сразу же выливают в воронку Бюхнера, растворитель отсасывают вакуумным насосом в копбу Бунзена, после чего смешанный сорбент сушат в сушильном шкафу при температуре не более 70-100° С до сыпучего состояния. 400 г готового сорбента засыпают IB колонку (отношение диаметра колонки к высоте со бента 1:1-1:2), слегка уплотняют, затем засыпают фосфоинозитидную фракцию, смешанную с силикагелем и сверху присыпают скяикагелем марки L 100/250 (Чехословакия) слое 3-5 см, наверх кладут фильтр. Для элюции используют: а)2 колоночных объема (0,8 л) хлорофор ма. б)10 колоночных объемов (4,5 п) хлороформ-метанола 8:2. Первые 3 колоночных объема (1,3 л) соде жат гликолипиды, нейтральные липиды и фосфатиднлэтаноламин. Оставшимися семью колоночными объемами элюируют фосфатидилзтано амин с чистотой около 97%. Выход фосфатидалзтаноламина 2г. в)6 колоночных объемов (2,75 л) хлороформ-метанола 2:8 используют для дочистки колонки. . г)9,3 колоночных объемов (4 л) ХЛОрОформ-метанол - 25% аммиак 65:25:5. Первые 6 колоночных объемов, содержащие полиглицерофосфатиды, фосфатидилглицерин, дифосфатидилглндерин и следа фосфоинозитида, отбрасывают. Оставшимися 3,3 колоночными объемами вымывают фосфоинозитид. Выход продукта 1 г с чистотой 99%, что соответству ет 80% от исходного количества фосфоино зитида в соевых фосфатидах или 2,6% от исходного количества субстрата. П р и м е р 2. Получение зкстракта проводят как в примере 1. Възделение фосфоинозитидной фракции про водят, как в примере 1. Соотношение лиоидного экстракта и окиси алюминия (L 40/250/ щелочной, Чехословакия) 1:3 (г/г). 24 г общего липидного экстракта в 800 мл хлороформ-метанола (1:1) смешивают с 72 г окиси алюминия. Выход фосфоинозитидной фракции 1,92 г (в 3,3 раза меньше, чем в примере 1). В состав фосфоинозитидной фрак ции входят фосфатидилзтанопамин, фосфатидил глицерин, дифосфатидилглицерин, полиглицерофосфатиды, фосфоинозитид и фосфатндная кнс лота.-1 Вьщеление фосфоинозитида. Полученную фосфоинозитидную фракцию (1,92 г) растворяют в 20 мл хлороформа, смешивают с 15 г силикагеля (L 100/250 /и. (Чехословакия), высушивают на роторном испарителе до сыпучего состояния и засьшают на колонку (как в примере 1) со 100 г смешанного сорбента - ДЕАЕ - целлюлоза с силикагелем в соотношении 1:1, приготовленно- . го как в примере 1. Соотношение фосфоннозитидной фракции и сорбента 1:55 (г/г). Для элюции используют: а)5 колоночных объема (0,7 л) хлороформа. б)20 колоночных объемов (2,8 л) хлороформ-метанола 8:2. Первые 7 колоночных объемов (1л) содержат гликолшшд, нейтральные липиды и фосфатндилэтаноламин. Оставшимися объемами злитрую1 600 мг фосфатидилэтаноламина с чистотой 92%. в)8 колоночными объемами (1,15 л) хлороформ-метанола 2:8 домывают колонку. г)17 колоночных объема (2,4 л) хлороформ-метанол - 25% аммиак 65;25:5. Первые |8 колоночных объемов, содержащие полиглицерофосфатид, фосфатидилглицерин, фосфоинозитид, фосфатидную кнслоту, отбрасывают. Оставшимися 9 колоночными объемами вымывают фосфоинозитид с примесью фосфатидной кислоты. Выход 130 мг с чистотой 70%. Выход составляет около 8% оТ исходного количества фосфоинозитида в соевых фосфатидах. П р и м е р 3. Экстракт получают, как в примере 1. Выделение фосфоинозитидной фракции. Процедуру выделения выполняют, как в примере 1. 24 г общего липидного зкстракта в 800 мл хлороформ-метанола (1:1) смешивают с 150 г окиси алюминия. Соотношение общего липидного экстракта и OKHCF алюминия 1:6 (г/г). Выход фосфоинозитндной фракции 2,88 г (в 2,2 раза (45%) шике, чем в примере 1.). Состав фосфоинозитидной фракции, как в примере 2. Выделение фосфоинозитида проводят по процедуре примера 1. Соотношение фосфоинозитидной фракции и сорбента 1:40 (г/г). 2,88 г фосфоинозитидной фракции отделяют на колонке с 120 г сорбента. Для злюшш используют: а)2 колоночных объема (036 л) хлорофор.ма. б)5 колоночных объемов (0,9 л) хлороформ-метанола 8:2. Первые 2 колоночных объема отбрасывают. Оставшимися объемами этоируют фосфатидилзтаноламин с фосфоииозитидом. Выход фосфатидилэтаноламина 1 г, чистота 90%. в)6 колоночными объемами (1,1 л) хлороформ-метанола 2:8 домьшают колонку. г) 16 колоночных объема (2,8 л) хлороформ-метанол - 25% аммиак 65:25:5. Первы 8 колоночных объемов, содержащие полиглицерофосфатвды, дифосфатвдилглицерин, фосфатвдилглицерин, фосфоинозитид, фосфатвдную кислоту, отбрасывают. Оставшимися объемами вымывают фосфоиноэитид с примесью фосфЕтидной кислоты. Выход 200 мг с чистотой 90%, что составляет 12% от исход ного количества фосфоинозитида в соевых фосфатидах. П р и м е р 4. Экстракт полутют, как примере 1. Вьщеление фосфоинозитидной фракции. 24 г общего липидного экстракта в 800 м хлороформ-метанола (1:1) смешивают с 480 г окиси алюминия. Соотношение обш;его липидного экстракта и окиси алюминия 1:20 (г/г). Далее процедуру выполняют, как в .примере 1. Выход фосфоинозитидной фракции 6,24 г. Состав фосфоинозитидной фракции, как в примере 1. Выделение фосфоинозитида проводят, как в примере 1. Выход ire чистотой 99%, что соответствует 80% от исходного количества фосфоин зитида в соевых фосфатидах. Примерз. Экстракт получают, как в примере 1. Выделение фосфоинозитидной фракции про водят по процедуре примера 1, Выделение фосфоииозктида. 5 г Фосфоипозитидной фракции смешиваю с силикагелем L 100/250 .и, (Чехословакия) как в примере 1. Подготовка колонки. ДЕАЕ-целлюлозу готовят, как в примере К готовой целлюлозй в метаноле добавляют 2 части (от количества ДЕАЕ-целлюлозы) силикагеля марки L 40/100уа (Чехословакия далее как в примере 1. 400 г готового сорбента засыпают в коло ку, слегка уплотняют, засыпают фосфоинозитидную фракцию, смешанную с силикагелем. Соотношение сорбента и фосфоинозитид ной фракции 80:1. Для элюции используют схему по пример Выход фосфоинозитида 1 г, чистота 99%. П р и м е р 6. Экстракт получают, как в примере 1. Выделение фосфоинозитидной фракции пр водят, как в примере 1., Выделение фосфоинозитида. 5 т фосфоинозит1щной фракции смешиваю с силикагелем L 100/250 (Чехословакия) .к в примере I. Подготовку колонки проводят, как в пр мере 1. К готовой Л, ЬА Е-целлюлозе в метан 8 е добавляют 4 части (от количества ДЕАЕеллюлозы) силикагеля L 40/100 (Чехослоакия) и далее процедуру выполняют, как в римере I. Соотношение фосфоинозитидной ракция и сорбента 1:80 (пример 1). Для элюции используют: а)2 колоночных объема (0,8 л) хлороорма. б)10 колоночных объемов (4,5 л) хлороорм-метанола 8:2. Фосфоинозитид злюируетя совместно с гликолипидами, нейтральными ипидами, фосфатидилзтаноламином. Для получения чистого фосфоинозитида коонка не годится. Пример. Экстракт получают, как в примере 1. Выделение фосфоинозитидной фракции проводят, как в- примере 4. Вьщеление фосфоинозитида. 5 г фосфоинозитидной фракции смешивают с силикагелем, как в примере 1. Подготовку колонки проводят, как в примере 1. К 5 частям готовой ДЕАН-целлюлозы добавляют 1 часть силикагеля L 40/100 u. (Чехословакия), далее процедуру проводят как в примере 1. При этом колонка имеет рыхлую упаковку сорбента и происходит проскок вешества уже с хлороформа. Для элюции используют: . а) 2 колоновдых объема (0,8 л) хлороформа: наблюдают проскок фосфоинозитида уже в хлороформе. б) хлороформ-метанол 8:2. Фосфоинозитид элюируется с фосфатидилэтаноламином, нейтральными липидами, гликолипидами. Для получения фосфоинозитида колонка не годится. П р и м е р 8. Предварительные процедуры, как в предыдущих примерах. Выделение фосфоинозитида как в примере 1, Соотношение ДЕАЕ-целлюлозы и силикагеля 10:1 (г/г). При ЭЛЮ11ЛИ с колонки наблюдается проскок фосфолипидов уже в хлороформе и далее разделения не происходит. Поэтому для вьщеления фосфоинозитида такая колонка не годится. ормула изобретения Способ вьоделения фосфоинозитида из соевых фосфатидов, включающий экстракцию фосфолипидов хлороформом и метанолом и очистку фосфоинозитида силикагелем, о т л и ч аю щ и и с я тем, что, с целью увеличения выхода целевого продукта, соевые фосфатиды подвергают последовательной экстракции ацетоном и хлороформ-метанолом, полученный экстракт отмывают водой, смешивают его с

995073010

окисью алюминия в весовом соотношении igradient salt elution in a mixed solvent system. 1:8 и подвергают очистке на колонке с су-J. of Biol Chem, 1964, 239, 1369-1373. хим смешанным сорбентом - смесью силика-2. Киселев Г. В. Препаративный метод полугеля с диэтиламиноэтилцеллюлозой, взятых в чения фракций фосфоинозитидов из ткани говесовом соотношении 1:1.5 ловного мозга- - Биохимия, 1977, 42 (12),

Источники информации,с. 2202-2205.

принятые во внимание при экспертизе,

1. Hendrickson Н. S. and Baffcu С. Е. Jon3. G. Colacicco, m. Rapport, J- Zihid Res.

exchange chromatography of intact brain phos-A simplified preparation of phosphatidyl

poinositides on diethylaminoethyl cellulose by-tO inosito. 1967, 8, (5), 513-515 (прототип).