Способ определения содержания фосфолипидов в сливочном масле Советский патент 1977 года по МПК G01N33/04 

Изобретение относится к пищевой промышленности. Известны различные способы определения содержания фосфолипидов в -сливочном масле. Наиболее близким к изобретению решением -поставленной задачи является широко используемый в настоящее время способ экстракции фосфолипидов из плазмы сливочного масла с последующим хроматографированием экстракта фосфолияидов в тонком слое силикагеля. Известный Способ экстракции фосфолипидов заключается в следующем. Сливочное масло (80-100 г) расплавляют при температуре 45°С и отделяют плазму центрифугированием. Плазму выдерживают при низких положительных температурах и удаляют застывшие частицы молочного жира. Полученную плазму разбавляют дистиллированной водой, добавляют последовательно NaCl, концентрированный раствор аммиака, этиловый спирт, смесь петролейного и диэтилового эфиров, встряхивают и отделяют орга-. ническую фазу. Затем к водной фазе вновь добавляют этиловый спирт, смесь эфиров, встряхивают и отделяют органическую фазу. Объединенные экстракты (органическая фаза) упаривают в вакууме, и полученный концентрат используют для определения фосфоилидов методом тонкослойной хроматографии. Однако на осуществление такого способа требуются значительные затраты сливочного масла, реактивов, труда и времени, при отборе плазмы сливочное масло необходимо выдерживать в течение довольно длительного промежутка времени при , что может привести к частичному гидролизу и окислению фоСфолипидов. Известным способом знается извлечь не более 90% фосфолипидов сливочного масла. Целью изобретения является интенсификация процесса, обеспечение полного выделения фосфолипидов и исключение изменения фосфолипидов в процессе анализа. Для этого по предлагаемому способу навеску сливочного масла растворяют в хлороформе с получением хлороформного экстракта фосфолипидов с молочным жиром и нерастворимого белкоБО-фосфолиПИДного остатка, на который воздействуют метиловым спиртом для получения метанольного раствора фосфолипидов с последующим удалением метанола упариванием в вакууме и смешиванием выделенных фосфолипидов с хлороформным экстрактом, полученный объединенный раствор наносят капилляром в одну точку на тонкий слой сорбента и затем хроматографируют в системе растворителей, например хлороформ-метанол-аммиак (25%-ный) в соотношении 14:6: 1.

Пример. К 1 г сливочного масла добавляют 1,3 мл хлороформа, выдерживают в течение 30 мин, фильтруют через бумажный фильтр, Осадок на фильтре промывают 0,5 мл хлороформа и затем отдельно 2 мл метилового спирта, после чего осадок (белок) отбрасывают. Спирт удаляют в вакууме при комнатной температуре, и к остатку приливают хлороформный экстракт. Объем смеси доводят до 2 мл хлороформом.

Полученный хлороформный раствор фосфолипидов и молочного жира используют для определения содержания фосфолипидов. С этой целью 100 мкл раствора наносят стеклянным капилляром (внутренний диаметр 0,5 мм, длина 40 мм) в одну точку в виде пятна (диаметр не более 12 мм) на хроматографическую пластину с тонким слоем силикагеля КСК (200 меш).

Для приготовления хроматографической пластины (12X18 см) тонкий слой из смеси силикагеля (6,0 г), гипса (0,3 г) и воды (15 мл) высушивают на воздухе в течение 24 час, активируют 40 мин при 105°С. При нанесении хлороформного раствора липидов сливочного масла на тонкий слой силикагеля КСК фосфолипиды прочно сорбируются в точке нанесения, в то время как нейтральные липиды (молочный жир) образуют пятно значительно большего диаметра из-за их легкой растворимости в хлороформе. При последуюш,ем хроматографировании в системе растворителей нейтральные липиды отделяются от старта и передвигаются с фронтом системы, а фосфолипиды в этой системе образовывают четкие компактные пятна, соответствующие

отдельным фракциям фосфолипидов. Хроматографию осуществляют в системе хлороформ-метанол-25%-ный аммиах (14:6:1 по объему).

После хроматографического разделения

пластину проявляют реактивом Баськовского и Костецкого, с которым только фосфолипиды дают синие продукты реакции. Проявленные хроматограммы подвергают фотоденсито.метрированию для определения содержания

суммы и отдельных фракций фосфолипидов. Следует от.метить, что хроматограммы можно использовать и для определения содержания фосфолипидов другим путем, т. е. экстракцией фосфолипидо-в из силикагеля с последующим

определением липидного фосфора сжиганием. Результаты определения содержания фосфолипидов в сливочном масле по известному и предлагаемому способам приведены в таблице.

Среднее значение ± стандартное отклонение (из пяти опытов).

Примечание. Определение фосфолипидов по обоим способам производят после хроматографии экстракта фотоденсиметрическим методом.

Из представленных данных видно, что при определении содержания фосфора известным и предложенным способами большее извлечение фосфолипидов (на 25-35%) наблюдается при использоваиии предложенного способа. Отсюда следует, что при использовании известного способа истинное содержание фосфолипидов удается определить лишь с большой ошибкой.

На чертеже представлены результаты тонкослойной хроматографии на силикателе КСК фоофолипидов сливочного масла:

I- сладкосливочное масло, фосфолипиды определены известным способом;

II-сладкосливочное масло, фосфолипиды определены предложенным способом;

III- «крестьянское сливочное масло, фосфолипиды определены известным способом;

IV- «крестьянское сливочное масло, фосфолипиды определены предложенным способом;

1-6 - кефалин, лецитин, сфингомиелин, серинфосфатид, инозитфосфатид, фосфатидные кислоты соответственно.

При использованпи известного способа выделения фосфолипиды частично разрушаются, поскольку, помимо основных фракций, на хроматограмме выявляются продукты их частичного разрушения (фосфатидные кислоты). В то же время при использовании предложенного способа продукты изменения фосфолипидов на хроматограмме не обнаруживаются (см. чертеж).

Формула изобретения

Способ определения содержания фосфоли65 пидов в сливочном масле, предусматривающий извлечение фосфолипидов с истгользованием хлороформа и метилового спирта и тонкослойную хроматографию выделенных фосфолипидов на силикателе, отличающийся тем, что, с целью ускорения и повышения точности анализа, навеску сливочного масла растворяют в хлороформе с получением хлороформного экстракта фосфолипидов с мо.лочным жиром и нерастворимого белковофосфолипидного остатка, на который воздействуют Метиловым спиртом для получения метанольного раствора фосфолипидов с последующим удалением метанола упариванием в вакууме и смешиванием выделенных фосфолипидов с хлороформным экстрактом, а полученный объединенный раствор наносят капилляром в одну точку на тонкий слой сорбента и затем хроматографируют в Системе растворителей, например хлороформ-метанол-аммиак 25%-ный в соотношении 14:6: 1.

- . X .